[發(fā)明專利]一種豬PMAIP1基因siRNA干擾片段及其應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201910554598.1
• 申請日: 2019-06-25
• 公開（公告）號: CN110283822B
• 公開（公告）日: 2022-11-18
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 張淑君;蔣金河;孫玉梅;王凱;王金玉;李欣雨
• 申請（專利權(quán)）人: 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;A61K31/713;A61P31/14
• 代理公司: 武漢開元知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 42104
• 代理人: 徐紹新

本發(fā)明公開了一種豬PMAIP1基因siRNA干擾片段，具有如序列表SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)豬Noxa蛋白在PRRSV病毒的復(fù)制中起到重要作用，抑制Noxa蛋白的表達(dá)會顯著抑制PRRSV病毒的復(fù)制，從而針對Noxa設(shè)計干擾片段并驗證了其功能。該干擾片段通過下調(diào)Noxa蛋白的表達(dá)發(fā)揮抑制PRRSV病毒的作用，在制備PRRSV病毒抑制劑以及在培育轉(zhuǎn)基因抗PRRSV豬中具有廣泛應(yīng)用前景。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。具體涉及一種干擾豬Noxa(PMAIP1基因)蛋白表達(dá)的siRNA片段，以及利用該siRNA干擾片段在抑制PRRSV病毒中的應(yīng)用。

背景技術(shù)

PRRS(Porcine reproductive and respiratory syndrome)豬繁殖與綜合癥，已在近20年來給全球養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大經(jīng)濟(jì)損失。在美國已被確定每年給美國養(yǎng)豬業(yè)帶來60億美元的損失[1]。PRRS是由豬繁殖與呼吸綜合癥病毒(PRRSV)引發(fā)的接觸性傳染病，主要引起懷孕母豬流產(chǎn)、早產(chǎn)、死胎和木乃伊胎等癥狀。同時會引發(fā)仔豬呼吸道疾病及斷奶前死亡率增高，仔豬發(fā)病率高達(dá)100％，死亡率在50％以上，母豬流產(chǎn)率在30％以上[2-4]。自從PRRSV發(fā)現(xiàn)以來，幾種弱毒疫苗已經(jīng)被研發(fā)并在幾個國家注冊。但是只能對不同的毒株起到部分的抵抗作用。而且有報道發(fā)現(xiàn)弱毒疫苗會和野生型的PRRSV毒株發(fā)生重組。因此，由于PRRSV病毒的自身的變異率高，目前對PRRS的治療和預(yù)防沒有特效的疫苗和藥物。

多篇文章研究表明細(xì)胞凋亡自噬在病毒感染增殖中起到了重要作用。其中Bcl-2家族蛋白在細(xì)胞凋亡自噬中起重要的作用[5-7]。Noxa蛋白是BH3-Only蛋白中的一員，BH3-Only蛋白則是屬于Bcl-2家族。Noxa蛋白最初鑒定為參與了由DNA損傷及一系列壓力變化誘發(fā)的p53調(diào)控的凋亡過程，隨后又有文章報道RNA病毒及dsRNA也會上調(diào)非p53依賴的Noxa，且Noxa在病毒誘發(fā)的凋亡中起到了重要作用[8-11]。

目前，關(guān)于Noxa的研究主要集中在其在p53依賴的凋亡途徑中促進(jìn)凋亡的作用，對于其在PRRSV感染中所起的作用，沒有任何相關(guān)報道。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種豬PMAIP1基因(編碼豬Noxa蛋白)的siRNA干擾片段，本發(fā)明的另一個目的是提供所述干擾片段在抑制豬繁殖與呼吸綜合癥病毒中的應(yīng)用。

本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)：

設(shè)計對豬PMAIP1基因特異的siRNA干擾序列。其序列如下所示：5’-GCCAUUCAGUUCAGAAGGATT-3’(SEQ ID NO:1)。通過人工合成該序列并轉(zhuǎn)染模型細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)它能夠有效降低細(xì)胞中Noxa(PMAIP1)的表達(dá)。

進(jìn)一步，通過體外細(xì)胞試驗，還發(fā)現(xiàn)上述siRNA干擾片段能夠抑制PRRSV病毒的復(fù)制和降低病毒滴度，從而驗證了該干擾片段通過下調(diào)Noxa蛋白的表達(dá)發(fā)揮抑制PRRSV病毒的作用。

所述siRNA干擾片段在制備PRRSV病毒抑制劑以及在培育轉(zhuǎn)基因抗PRRSV豬中具有廣泛應(yīng)用前景。

本發(fā)明的有益效果是：首次發(fā)現(xiàn)豬Noxa蛋白在PRRSV病毒的復(fù)制中起到重要作用，抑制Noxa蛋白的表達(dá)會顯著抑制PRRSV病毒的復(fù)制，從而針對Noxa設(shè)計干擾片段并驗證了其功能。

附圖說明

圖1：western blot檢測siRNA干擾片段對Noxa蛋白的干擾效率。

圖2：熒光定量檢測PRRSV病毒中ORF7和Nsp2mRNA表達(dá)水平。

圖3：TCID₅₀檢測PRRSV病毒的滴度。

具體實施方式

以下通過具體實施例對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)地說明。