[發(fā)明專利]一種用于化膿鏈球菌檢測的試劑盒有效
| 申請?zhí)枺?/td> | 201910549665.0 | 申請日： | 2019-06-24 |
| 公開（公告）號： | CN110241238B | 公開（公告）日： | 2020-03-03 |
| 發(fā)明（設(shè)計）人： | 孫澤瑋;陳文靜;鄭良榮 | 申請（專利權(quán)）人： | 浙江大學(xué) |
| 主分類號： | C12Q1/689 | 分類號： | C12Q1/689;C12Q1/6844;C12Q1/14 |
| 代理公司： | 杭州求是專利事務(wù)所有限公司 33200 | 代理人： | 趙杭麗 |
| 地址： | 310058 浙江*** | 國省代碼： | 浙江;33 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 一種 用于 化膿 鏈球菌 檢測 試劑盒 | ||
本發(fā)明提供一種用于化膿鏈球菌檢測的試劑盒，包含一種特異性靶向化膿鏈球菌rpoB基因的向?qū)NA、擴增引物對、水化TwistAmp basic kit反應(yīng)干燥球、LbCas12a蛋白、單鏈DNA探針(ssDNA)、Ribonuclease Inhibitor和緩沖液。使用該試劑盒進行化膿鏈球菌檢測，檢測的特異性高，可以將化膿鏈球菌與其他鏈球菌，包括停乳鏈球菌、無乳鏈球菌區(qū)分開來。同時，使用本發(fā)明所述RNA序列進行檢測，耗時在1小時左右，不需要PCR儀，對設(shè)備要求低，顯著低于傳統(tǒng)的細菌培養(yǎng)法或PCR測序法，臨床實用價值大。
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于致病菌檢測領(lǐng)域，涉及一種用于化膿鏈球菌檢測的試劑盒。利用此試劑盒可以進行化膿鏈球菌快速檢測。
背景技術(shù)
化膿鏈球菌是人體感染的革蘭陽性菌中常見菌群，給患者及社會帶來巨大負擔。傳統(tǒng)的檢測方法是進行細菌培養(yǎng)或PCR聯(lián)合測序，但細菌培養(yǎng)需要5-7天的時間，而PCR常由于缺乏特異性引物，無法將化膿鏈球菌與其他鏈球菌區(qū)分，故而需要聯(lián)合一代測序才能鑒定，成本高，需要數(shù)天時間才能出結(jié)果。在這期間臨床醫(yī)師由于沒有獲得檢測結(jié)果，只能憑經(jīng)驗用藥，常常導(dǎo)致疾病治療的延誤。因而，如何快速檢測化膿鏈球菌顯得尤為重要。近期，張峰等人發(fā)現(xiàn)，LbCas12a蛋白可用于致病菌的檢測，只需要1小時左右即可完成檢測，省時省力，靈敏度高。具體的原理為，該系統(tǒng)包含LbCas12a蛋白、致病菌DNA、向?qū)NA、兩端分別帶熒光基團和淬滅基團的單鏈DNA(ssDNA)。其中，致病菌DNA序列需要包含TTTN的PAM結(jié)構(gòu)，同時該序列需要具備特異性，即區(qū)別于別的致病菌。而向?qū)NA序列為致病菌特異性靶向序列中TTTN后的一段序列，長度為20-24個堿基。在向?qū)NA引導(dǎo)下，LbCas12a蛋白可結(jié)合到致病菌特異性DNA序列上，隨后，LbCas12a蛋白可表現(xiàn)出Dnase活性，從而切割兩端分別帶熒光基團和淬滅基團的單鏈DNA，使得熒光基團和淬滅基團分離，出現(xiàn)熒光，從而指示致病菌的存在。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種用于化膿鏈球菌檢測的試劑盒，包含一種特異性靶向化膿鏈球菌rpoB基因的向?qū)NA、RPA擴增引物對、水化TwistAmp基礎(chǔ)試劑盒(TwistAmpbasic kit)反應(yīng)干燥球、LbCas12a蛋白、單鏈DNA探針(ssDNA)、RNA酶抑制劑(RibonucleaseInhibitor)和緩沖液。其中特異性靶向化膿鏈球菌rpoB基因的向?qū)NA，其核苷酸序列如SEQ No.1所示，能特異性靶向化膿鏈球菌，而不能靶向停乳鏈球菌、無乳鏈球菌，可用于化膿鏈球菌的檢測。其中RPA擴增引物對RPA-F和RPA-R，序列如SEQ No.2和SEQ No.3所示。單鏈DNA探針的序列如SEQ No.6所示。
本發(fā)明的另一個目的是提供所述試劑盒進行化膿鏈球菌快速檢測的方法，通過以下步驟實現(xiàn)：
具體步驟為：取1ml樣品，95-98攝氏度加熱5min，取1μl作為檢測樣品，加入14.75μl水化TwistAmp basic kit反應(yīng)干燥球(TwistDx公司)，0.9μl 10mM RPA-F(序列為SEQNo.2)和RPA-R(序列為SEQ No.3)，0.375μl Ribonuclease Inhibitor(Takara公司)，3.5μlbuffer2.1(NEB公司)，1000nM向?qū)NA(序列為SEQ No.1)，250nM Cas12a(NEB公司)，200nM單鏈DNA探針(上海生工，序列為SEQ No.6)，加水補至25μl。37攝氏度反應(yīng)25-45min，通過熒光顯微鏡下直接觀察檢測體系熒光變化，進行化膿鏈球菌檢測；發(fā)黃綠色熒光說明有化膿鏈球菌污染，不發(fā)光說明沒有化膿鏈球菌污染。本方法可以將化膿鏈球菌與其他鏈球菌，包括停乳鏈球菌、無乳鏈球菌區(qū)分開來。
其中：
所述單鏈DNA探針ssDNA序列(SEQ No.6)為：5’6-FAM-TTATT-3’BHQ1，由上海生工合成。
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