[發明專利]一種液相色譜串聯質譜法定量血漿中百草枯試劑盒及其制備

在審

• 申請號: 201910541264.0
• 申請日: 2019-06-21
• 公開（公告）號: CN110297059A
• 公開（公告）日: 2019-10-01
• 發明（設計）人: 李鵬飛;劉麗宏;安卓玲;劉河;范家明;杜萍
• 申請（專利權）人: 首都醫科大學附屬北京朝陽醫院
• 主分類號: G01N30/88
• 分類號: G01N30/88
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發明提供了一種高靈敏液相色譜串聯質譜法定量血漿中百草枯試劑盒及其制備方法。試劑盒由特定濃度的標準曲線血漿樣本、質控血漿樣本、內標液、流動相調節液組成。血漿樣本以百草枯?d8為內標，用乙腈沉淀，采用Thermo acclaim trinity Q1為固定相，以乙腈?100mmol/L甲酸銨和0.4％甲酸的水溶液為流動相進行色譜梯度分離，運用質譜儀進行定量檢測，離子選擇通道分別為m/z93.1→171.2(百草枯)和m/z97.1→179.2(百草枯?d₈)。本發明的試劑盒，測試靈敏度可達到1.0ng/ml，各項方法學指標均可滿足血漿中百草枯血藥濃度定量檢測的需要。

技術領域

本發明涉及一種基于液相色譜串聯質譜技術開發的血漿中百草枯定量檢測試劑盒，更具體地說是采用液相色譜質譜技術對血漿中百草枯進行準確定量檢測的方法。

本發明還涉及本發明試劑盒的生產方法和應用。

背景技術

百草枯(PQ)是一種高極性的化合物，世界上使用最廣泛的速效觸殺型除草劑之一，在許多國家用于農業雜草的防治。百草枯既是一種除草劑，又是一種劇毒毒物。百草枯大鼠經口給藥LD₅₀為150mg/kg，盡管在毒理學分類上被列為中等毒性毒物，但由于目前沒有有效的解救藥物，口服死亡率為90％，臨床上應列為劇毒毒物。在過去的幾十年里，出現了越來越多的關于百草枯意外中毒的報道，百草枯中毒死亡率非常高。百草枯的毒性作用可發生在多個器官，肺是百草枯中毒損傷的主要靶器官之一，它同時會造成嚴重的肝腎損害。百草枯中毒晚期則出現肺泡內和肺間質纖維化，稱為“百草枯肺”，是急性呼吸窘迫綜合征的一種變異形式。雖然百草枯毒性致死的主要原因是嚴重的肺損傷，但急性腎衰竭是百草枯毒性中觀察到的第一個全身癥狀。急性百草枯中毒(acute paraquat poisoning)是指短時間接觸較大劑量或高濃度百草枯后出現的以急性肺損傷為主，伴有嚴重肝腎損傷的全身中毒性疾病，口服中毒患者多伴有消化道損傷，重癥患者多死于呼吸衰竭或多臟器功能衰竭。近百草枯中毒最常見的治療方法是用膨潤土使胃中的百草枯失活，或通過血液灌流法清除血液中百草枯。目前，每年約有上萬人因百草枯中毒而喪失生命，急性百草枯中毒目前尚無解毒藥物，救治仍處于探索中。清除進入體內的百草枯，改善百草枯的毒物分布情況，可能是目前救治急性百草枯中毒患者的基礎和可行途徑之一。

臨床通過以下四種方式推斷患者百草枯中毒后的預后情況：①通過研究計算得出的服毒量界值推斷中毒200h內或4～24h間患者預后；②百草枯中毒嚴重指數(SIPP＝中毒到急診時間×血漿百草枯濃度，h·mg/L)＞10或計算得出的cutoff推斷中毒200h內或4～24h間患者預后；③Jones生存回歸方程：生存概率＝exp(logit)/[1+exp(logit)]，logit＝0.58-2.33×log10血漿百草枯濃度-1.15×log10中毒到急診時間；④Proudfoot生存曲線推斷中毒4～24h間患者預后：血漿百草枯濃度在4、6、10、16和24h分別小于2.0、0.6、0.3、0.16和0.1mg/L的患者可能存活。臨床中百草枯中毒患者預后評價需要準確定量體內百草枯濃度。

百草枯受自身理化性質因素影響，在反相色譜柱上很難保留，濃度測定存在較大難度，百草枯的分析檢測方法有紫外分光光度法、色譜法、毛細管電泳法等多種方法，其提取方法也有液液萃取法、固相萃取法等多種，但操作繁瑣，費時費力，不利于臨床實踐應用。目前國內外報道的檢測方法主要有氣相色譜串聯質譜法(GC-MS)、液相色譜法(HPLC)和液相色譜串聯質譜法(LC-MS/MS)。LC-MS/MS法是液相色譜作為分離系統與質譜作為檢測系統的分析方法。它集LC的高分離性能與MS的高靈敏性、強專屬性于一體，較好地適應了體內藥物分析對高通量、高精密度和準確度的需求，近年得到越來越廣泛地應用。

研究開發一種結果準確、價格低廉、操作簡便、易于推廣的LC-MS/MS定量血漿中百草枯試劑盒，使其能廣泛應用于我國百草枯中毒患者體內毒物濃度監測中，通過準確定量血漿中百草枯濃度實現百草枯患者的精準預后評價。

發明內容