[發明專利]一種尿液外泌體ELISA的檢測方法及其應用

在審

• 申請號: 201910541257.0
• 申請日: 2019-06-21
• 公開（公告）號: CN110187101A
• 公開（公告）日: 2019-08-30
• 發明（設計）人: 江海松;張杰文;富磊;孫瑞華
• 申請（專利權）人: 上海惠皓醫療科技有限公司
• 主分類號: G01N33/558
• 分類號: G01N33/558;G01N33/535
• 代理公司: 上海海貝律師事務所 31301
• 代理人: 范海燕

本發明公開了一種外泌體檢測的ELISA方法，還提供一種檢測尿液外泌體的ELISA檢測方法在阿爾茨海默病的評估和防治方面的應用。本方法具有可靠、快速、經濟地無創檢測外泌體的特點，本發明的檢測方法也不需要昂貴且精密的實驗儀器，具有很大的應用前景。

技術領域

本發明涉及生物技術領域，具體為一種尿液外泌體ELISA的檢測方法及其應用。

背景技術

阿爾茨海默病(Alzheimer disease，AD)是一種中樞神經系統變性病，其特征性病理標記是細胞外的淀粉樣沉積和細胞內的神經原纖維纏結，分別由淀粉樣前體蛋白裂解產物Aβ和微管相關蛋白tau組成。臨床上阿爾茨海默病患者主要表現為漸進性記憶障礙、認知功能障礙、語言障礙等。

阿爾茨海默病的診斷過去依賴模糊的臨床診斷或者建立在尸檢的基礎上，隨著科學技術的發展，現在可以通過腦脊液檢查和PET檢查來確立診斷。由于阿爾茨海默病患者通常伴隨著嚴重的精神行為異常，這意味著腰椎穿刺對他們來講是非常困難的，此外PET檢查價格比較昂貴，將會給病人及家屬帶來更加沉重的經濟負擔。所以這兩個檢查均不能廣泛應用于臨床，導致相當一部分阿爾茨海默病的臨床診斷依舊依賴于臨床癥狀和磁共振檢查。但是通過臨床癥狀和物理檢查確立的診斷結果不夠準確，而且大部分人在被發現的時候已經處于晚期階段，沒有藥物可以逆轉。

外泌體是體內大多數細胞分泌的納米級的小囊泡，可存在于體液中，包括血液、唾液、尿液、腦脊液、乳汁等。神經來源外泌體有其獨特的神經特異表面標記物，這使得其能在循環體液中特異地被檢測出來。細胞膜內陷形成小的細胞內小泡，逐漸成熟融合形成多泡體，多泡體向內出芽形成腔內小泡。多泡體與溶酶體融合導致其內容物的裂解，與細胞膜融合導致外泌體被釋放到細胞外空間。因為外泌體可以自由地穿過血腦屏障進入血液，然后經腎臟進入尿液，神經來源外泌體可以直接反映大腦環境的變化。由于外泌體內容物包括核酸、蛋白質、脂質，所以在疾病狀態下外泌體的形態和數量會發生變化，而且它們的膜可以保護其內容物不被降解，因此，它們可以傳播病理性蛋白質，也可以被濃縮來提高檢測的敏感性，這些特征使得外泌體成為一個有價值的診斷工具。外泌體已經被證明可以在細胞間傳播毒性Aβ和高度磷酸化的tau，在阿爾茨海默病中導致神經元的丟失。多年的研究表明外泌體中Aβ和tau的水平在疾病出現臨床癥狀之前很長時間能夠預測到阿爾茨海默病的發展。

因此，發展一種能夠可靠、快速、經濟地無創檢測外泌體尤其是阿爾茨海默病患者來源的外泌體的方法非常必要。

發明內容

針對背景技術中存在的問題，本發明提供了一種尿液外泌體ELISA的檢測方法及其應用。

為實現上述目的，本發明提供如下技術方案：

一種尿液外泌體ELISA的檢測方法，包括如下具體步驟：

(1)收集健康志愿者/阿爾茨海默病患者尿液樣本，并將其存放于超低溫冰箱里，保存備用；

(2)從超低溫冰箱里取出健康志愿者/阿爾茨海默病患者尿液樣本，在2-6℃條件下解凍，然后將尿液樣本分別轉移到試管中，離心，去除細胞和細胞碎片，將上清液分別轉移到無菌試管中；

(3)在步驟(2)的上清液中各加入經Exo Quick提取的外泌體沉淀，通過反轉或輕彈試管使其混合均勻，在低溫冰箱中冷藏過夜，離心，吸取上清液，再次離心，去除所有的上清液，注意吸取上清液的過程中不要觸碰到試管底部的白色外泌體沉淀；

(4)在步驟(3)的白色外泌體沉淀中加入蛋白裂解液和蛋白抑制劑，渦旋，將沉淀重懸于溶液中，將溶液置于超低溫冰箱里放置5min，然后置于25℃水浴鍋中5min，如此重復數次，將溶液存放于超低溫冰箱里，在需要的時候拿出來溶化；