[發明專利]一種甘藍型油菜基因突變體PTG8的構建方法及其應用

有效

• 申請號: 201910536959.X
• 申請日: 2019-06-20
• 公開（公告）號: CN110257421B
• 公開（公告）日: 2021-01-15
• 發明（設計）人: 周永明;黃會斌;范楚川;崔婷婷
• 申請（專利權）人: 華中農業大學
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;C12N15/53;A01H5/00;A01H6/20
• 代理公司: 北京金智普華知識產權代理有限公司 11401
• 代理人: 楊采良

本發明屬于遺傳作物基因工程技術領域，尤其涉及一種甘藍型油菜基因突變體PTG8的構建方法及其應用。其技術要點包括根據甘藍型油菜BnaC.FAD2.a和BnaA.FAD2.a基因核苷酸序列設計并篩選兩個堿基位點的靶點序列，并針對靶點序列設計引物；構建雙靶點基因編輯載體BnPTG8載體；BnPTG8載體與受體材料遺傳轉化，獲得基因突變體。本發明通過對多個不同來源的甘藍型冬油菜品系進行篩選，獲得了高效穩定轉化基因型受體材料ZP1，對該受體材料精確編輯獲得BnaC.FAD2.a單突變體和BnaC.FAD2.aBnaA.FAD2.a基因雙突體，為建立高效的冬油菜遺傳轉化技術平臺奠定了基礎，為甘藍型油菜脂肪酸改良提供了新的種質資源。

技術領域

本發明屬于遺傳作物基因工程技術領域，尤其涉及一種甘藍型油菜基因突變體PTG8的構建方法及其應用。

背景技術

甘藍型油菜的遺傳轉化可通過多種途徑實現，其中根癌農桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)介導的遺傳轉化是目前最常用、轉化效率最高的方法。但是農桿菌介導的轉化方法受到多種因素的影響。冬油菜是我國油菜栽培的主要類型，但冬油菜的遺傳轉化效率較低，也缺乏高效穩定的基因型。因此，篩選農藝性狀優良、轉化效率高的甘藍型冬油菜轉化基因型，并建立完善與之配套高效穩定的油菜轉化體系非常具有應用價值。

油菜是我國重要的油料作物和食用植物油來源。油菜的脂肪酸改良主要是從不同的用途展開，其中最受關注的一方面是提高油菜油酸含量，改善菜籽油的品質。FAD2基因是△12-油酸去飽和酶的編碼基因，對油酸向亞油酸合成過程具有關鍵作用。

到目前為止，涉及甘藍型油菜FAD2基因的A5拷貝已經被研究和應用，A5拷貝不同位置的突變得到了不同高油酸含量的材料。但FAD2基因C5拷貝突變及A5C5兩個拷貝同時突變能提高油酸含量的技術尚未有報道。

發明內容

針對現有技術存在的問題，本發明提供了一種甘藍型油菜基因突變體PTG8的構建方法及其應用。

本發明是這樣實現的，一種甘藍型油菜基因突變體PTG8的構建方法，包括以下步驟：

S1：根據甘藍型油菜BnaC.FAD2.a和BnaA.FAD2.a基因核苷酸序列設計并篩選兩個堿基位點的靶點序列，并針對靶點序列設計引物；

S2：構建雙靶點基因編輯載體BnPTG8載體；

S3：BnPTG8載體與受體材料遺傳轉化，獲得基因突變體。

進一步，步驟S3中所用受體材料為ZP1品系植株。

進一步，步驟S1中兩個靶點序列分別見SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6。

進一步，步驟S1中針對靶點序列設計的引物序列分別見SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12。

進一步，所獲得的基因突變體為C5拷貝突變體，具體為BnaC.FAD2.a基因第437位處缺失3個堿基，所缺失的堿基為CAA。

進一步，所獲得的基因突變體為A5C5兩個拷貝同時突變的雙突變體，具體為BnaC.FAD2.a基因第440和441位處插入1個堿基，插入堿基為A；BnaA.FAD2.a基因第568-571位處缺失4個堿基，所缺失的堿基為AGCC，第599位處缺失1個堿基，所缺失的堿基為T。

進一步，步驟S2中構建雙靶點基因編輯載體BnPTG8載體的步驟包括：獲取sgRNA序列片段；將獲得的sgRNA序列片段依次連接；將連接產物酶切后與載體連接；將連接成功的載體轉入農桿菌GV3101感受態細胞，得到BnPTG8載體農桿菌菌株。

如上述的甘藍型油菜基因突變體PTG8的構建方法在油菜育種中的應用。