[發(fā)明專利]一種基于LAMP技術(shù)的安卡拉病毒快速檢測方法及引物組合物在審
| 申請?zhí)枺?/td> | 201910536499.0 | 申請日： | 2019-06-20 |
| 公開（公告）號： | CN110157840A | 公開（公告）日： | 2019-08-23 |
| 發(fā)明（設(shè)計）人： | 韓新鋒;趙艷;姜朕元;李佳康;黃雪琳;周海洋;申玉璽;趙勤;黃勇 | 申請（專利權(quán)）人： | 四川農(nóng)業(yè)大學(xué) |
| 主分類號： | C12Q1/70 | 分類號： | C12Q1/70;C12Q1/6844;C12N15/11;C12R1/93 |
| 代理公司： | 成都正華專利代理事務(wù)所(普通合伙) 51229 | 代理人： | 李蕊 |
| 地址： | 611134 四*** | 國省代碼： | 四川;51 |
| 權(quán)利要求書： | 查看更多 | 說明書： | 查看更多 |
| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 引物組合物 基層檢測 快速檢測 病毒 提取病毒DNA 特異性強 環(huán)引物 靈敏度 內(nèi)引物 外引物 備用 檢測 | ||
1.一種基于LAMP技術(shù)的安卡拉病毒快速檢測方法，其特征在于，包括以下步驟：
(1)分別設(shè)計內(nèi)引物、外引物和環(huán)引物，具體序列如下：
外引物：
F3:5’-ACAAGTTCAGACAGACGGTC-3’；
B3:5’-GCAGTAGGGCTTGAAGGAC-3’；
內(nèi)引物：
FIP:5’-GTCGTCGGTTTGGATGGGGTAA-ATGTCACGACAGAAAAGGCT-3’；
BIP:5’-ACAACATCAATGTGGGCGACGG-TCGGTCTAGGATTCCCTTGA-3’；
環(huán)引物：
LF:5’-GCGGATTTGCAGCCGTT-3’；
LB:5’-ACGCCGGAAATCTTCGTCACC-3’；
(2)提取安卡拉病毒DNA備用；
(3)建立反應(yīng)體系，其具體包括：4～14mM MgSO4、1～3mM dNTP mix、1～2μM內(nèi)引物、0.1～0.5μM外引物、0.1～1μM環(huán)引物、300～400U/mL Bst 3.0 DNA聚合酶、2.5～5μL 10×Thermopol reaction buffer、120～150μmol/L金屬離子指示劑、1～3μL安卡拉病毒DNA模板，最后用ddH2O補足至25～50μL；
(4)將步驟(3)建立的反應(yīng)體系置于60～70℃的恒溫體系中反應(yīng)60～80min，然后再在80～90℃反應(yīng)5～10min即可。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于LAMP技術(shù)的安卡拉病毒快速檢測方法，其特征在于，步驟(3)中所述反應(yīng)體系包括：6mM MgSO4、1.4mM dNTP mix、1.6μM內(nèi)引物、0.2μM外引物、0.4μM環(huán)引物、320U/mL Bst 3.0 DNA聚合酶、2.5μL 10×Thermopol reaction buffer、120μmol/L金屬離子指示劑、2μL安卡拉病毒DNA模板，最后用ddH2O補足至25μL。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的基于LAMP技術(shù)的安卡拉病毒快速檢測方法，其特征在于，所述內(nèi)引物FIP和BIP加入量均為1.6μM；所述外引物F3和B3的加入量均為0.2μM；所述環(huán)引物L(fēng)F和LB的加入量均為0.4μM。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的基于LAMP技術(shù)的安卡拉病毒快速檢測方法，其特征在于，所述金屬離子指示劑為羥基萘酚藍(lán)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的基于LAMP技術(shù)的安卡拉病毒快速檢測方法，其特征在于，所述10×Thermopol reaction buffer包括0.1％TritonX-100、20mmol/L Tris-HCL、10mmol/L KCL、5mmol/L MgSO4，以及10mmol/L(NH4)2SO4。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于LAMP技術(shù)的安卡拉病毒快速檢測方法，其特征在于，步驟(4)中所述反應(yīng)過程為：將步驟(3)建立的反應(yīng)體系置于65℃的恒溫水浴鍋中反應(yīng)60min，然后再在80℃反應(yīng)5min，去除Bst 3.0 DNA聚合酶活性即可。
7.一種用于進(jìn)行環(huán)介導(dǎo)等溫擴增檢測的引物組合物，其特征在于，該引物組合物包括內(nèi)引物、外引物和環(huán)引物，具體序列如下：
外引物：
F3:5’-ACAAGTTCAGACAGACGGTC-3’；
B3:5’-GCAGTAGGGCTTGAAGGAC-3’；
內(nèi)引物：
FIP:5’-GTCGTCGGTTTGGATGGGGTAA-ATGTCACGACAGAAAAGGCT-3’；
BIP:5’-ACAACATCAATGTGGGCGACGG-TCGGTCTAGGATTCCCTTGA-3’；
環(huán)引物：
LF:5’-GCGGATTTGCAGCCGTT-3’；
LB:5’-ACGCCGGAAATCTTCGTCACC-3’。
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