[發(fā)明專利]一種基于DNA條形碼鑒定黑果枸杞的方法及其應用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201910536233.6
• 申請日: 2019-06-20
• 公開（公告）號: CN110229927A
• 公開（公告）日: 2019-09-13
• 發(fā)明（設計）人: 焦劼;湯健儉
• 申請（專利權）人: 上海諾德生物實業(yè)有限公司
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/686
• 代理公司: 上海順華專利代理有限責任公司 31203
• 代理人: 顧蘭芳

1.一種基于DNA條形碼鑒定黑果枸杞的方法，其特征在于，

所述鑒定黑果枸杞的DNA條形碼基因序列為LRITS2/LRpsbA-trnH。

2.根據(jù)權利要求1所述一種基于DNA條形碼鑒定黑果枸杞的方法，其特征在于，所述鑒定黑果枸杞的DNA條形碼基因序列LRITS2如SEQ ID NO.1所示的DNA序列。

3.根據(jù)權利要求1所述一種基于DNA條形碼鑒定黑果枸杞的方法，其特征在于，所述鑒定黑果枸杞的DNA條形碼基因序列LRpsbA-trnH如SEQ ID NO.2所示的DNA序列。

4.如權利要求1所述一種基于DNA條形碼鑒定黑果枸杞的方法，其特征在于，該方法包括下列步驟：

(一)DNA的提取

分別取0.5g的黑果枸杞干凈無霉變的果實和果實粉樣本，作好標記后迅速放入液氮中，儲存于-80℃冰箱中，備用；

樣品基因組DNA采用CTAB法提取方法如下：

(1)研缽用液氮預冷，CTAB提取液于65℃預熱，滅菌的2mL離心管置于冰上，備用；

(2)將樣品放于研缽，加0.01g PVP后，加液氮研磨至粉末，邊研磨邊加入液氮；

(3)將粉末轉入2mL離心管內(nèi)，離心管內(nèi)預加入800μL預熱的CTAB提取液，1μL巰基乙醇，2‰，于65℃水浴1h，每隔10min輕搖一次，使其混合；

(4)向混合液中加入相同體積的酚/氯仿/異戊醇25∶24∶1混合液，輕顛倒使其充分反應10min后，于4℃，12000rpm離心15min；

(5)離心后取上清，加2.5μL的RNase，10mg/mL，37℃保溫1h，加入等體積氯仿/異戊醇24∶1，輕搖混勻10min，4℃，12000rpm離心15min。重復洗脫1次；

(6)離心后取上清，置入新的2mL EP離心管，加入2/3上清液體積的于-20℃預冷的異丙醇，1/10體積3M NaAC，pH＝5.2，混勻，-20℃放置1h或者過夜；

(7)取出放于冰上10min，4℃，12000rpm離心10min，棄上清；

(8)沉淀物用70％的乙醇(200μL)漂洗，12000rpm離心5min，漂洗3次后，置于超凈臺晾干30min，用ddH₂O溶解；

提取好的DNA樣品用NanoDrop 2000檢測，并稀釋為30ng/μL，儲存于-20℃冰箱中，備用；

(二)PCR擴增

(1)PCR擴增引物和篩選

ITS2和psbA-trnH的通用引物，表1

表1 ITS2和psbA-trnH的通用引物

表2 DNA條形碼反應體系

配制表1中20μL體系的PCR反應混合物。在1.5mL EP離心管中分別加入表2中物質(zhì)，混勻后放入PCR擴增儀中，即得到DNA條形碼基因序列為LRITS2/LRpsbA-trnH；

PCR循環(huán)反應條件設置如下：94℃，5min；30循環(huán)，94℃1min，55℃1min，72℃1.5min；72℃，7min；

PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測后，在紫外凝膠成像系統(tǒng)下觀察擴增結果，擴增結果表明，ITS2和psbA-trnH序列的長度均在500bp。

5.如權利要求1所述DNA條形碼序列基因ITS2或psbA-trnH基因在鑒定黑果枸杞中的應用。

6.根據(jù)權利要求5所述一種基于DNA條形碼鑒定黑果枸杞的方法，其特征在于，所述鑒定黑果枸杞的DNA條形碼基因序列LRITS2/LRpsbA-trnH可以同時或任選其中之一用于鑒定黑果枸杞。