[發明專利]一種基于纖維小體的畢赤酵母表面共展示系統及其構建方法和應用

在審

• 申請號: 201910531405.0
• 申請日: 2019-06-19
• 公開（公告）號: CN110229220A
• 公開（公告）日: 2019-09-13
• 發明（設計）人: 李迅;王亮亮;王月皎;李文謙;王飛;張瑜
• 申請（專利權）人: 南京林業大學
• 主分類號: C07K14/39
• 分類號: C07K14/39;C12N15/31;C12N1/19;C12N15/81;C12N15/70;C12N1/21
• 代理公司: 北京高沃律師事務所 11569
• 代理人: 呂紀濤

1.一種基于纖維小體的畢赤酵母表面共展示系統，其特征在于，包括錨定蛋白和多蛋白展示底架蛋白，所述錨定蛋白為釀酒酵母細胞壁蛋白Sed1p；所述多蛋白展示底架蛋白為梭菌纖維小體的人工迷你腳手架蛋白MixA2。

2.權利要求1所述的基于纖維小體的畢赤酵母表面共展示系統的構建方法，其特征在于，包括如下步驟；

(1)將基因構建物GMsed1插入pPICZαA載體，獲得重組質粒pPICZαA-GMsed1；所述基因構建物GMsed1包括Sed1p、MixA2和綠色熒光蛋白eGFP的基因；

(2)將步驟(1)所述重組質粒pPICZαA-GMsed1導入畢赤酵母細胞，根據表達載體上的篩選標記篩選得到展示迷你腳手架蛋白MixA2的重組畢赤酵母陽性轉化子，獲得重組畢赤酵母細胞；

(3)培養步驟(2)所述重組畢赤酵母細胞，在細胞表面展示表達基于纖維小體的腳手架蛋白MixA2；

(4)將基因構建物mCherry-CtDoc和/或mCherry-CcDocRK分別插入pET20b的載體中，獲得重組質粒pET20b-L1-mcherry-L2-CtDoc和/或pET20b-L1-mcherry-L2-CcDocRK；所述基因構建物mCherry-CtDoc包括紅色熒光蛋白mCherry和對接模塊Ctdockerin的基因；所述基因構建物mCherry-CcDocRK包括紅色熒光蛋白mCherry和對接模塊Ccdockerin的基因；

(5)將步驟(4)所述重組質粒pET20b-L1-mcherry-L2-CtDoc和/或pET20b-L1-mcherry-L2-CcDocRK分別導入大腸桿菌細胞，根據表達載體上的篩選標記篩選得到陽性轉化子，獲得重組大腸桿菌細胞；

(6)培養和誘導步驟(5)所述重組大腸桿菌細胞，獲得重組外源蛋白mCherry-CtDoc和/或mCherry-CcDocRK；

(7)通過腳手架蛋白MixA2上的黏結模塊cohesin和mCherry上的對接模塊dockerin之間的特異性相互作用，構建得到基于纖維小體的畢赤酵母表面共展示系統；

所述步驟(1)～(3)和所述步驟(4)～(6)之間無時間順序的限定。

3.根據權利要求2所述的基于纖維小體的畢赤酵母表面共展示系統的構建方法，其特征在于，

步驟(1)所述基因構建物GMsed1從5’到3’依次包括以下相連的元件：

(a)來自于維多利亞多管發光水母的增強型eGFP編碼序列；

(b)來自于梭菌纖維小體的人工迷你腳手架蛋白黏結模塊Ctcohesin編碼序列；

(c)GS linker：GGGGSGGGGS

(d)來自于梭菌纖維小體的人工迷你腳手架蛋白黏結模塊Cccohesin編碼序列；

(e)SA linker：SAPGTPSRGAAA

(f)釀酒酵母細胞壁蛋白Sed1p編碼序列。

4.根據權利要求3所述的基于纖維小體的畢赤酵母表面共展示系統的構建方法，其特征在于，步驟(1)所述基因構建物GMsed1的基因序列如SEQ ID No.24所示。

5.根據權利要求2所述的基于纖維小體的畢赤酵母表面共展示系統的構建方法，其特征在于，

步驟(4)所述基因構建物mCherry-CtDoc從5’到3’依次包括以下相連的元件：

(a’)修飾改造過的來自于盤狀海葵(Discosoma sea anemones)的mCherry編碼序列；

(b’)來自于梭菌纖維小體的人工迷你腳手架蛋白對接模塊Ctdockerin編碼序列；

步驟(4)所述基因構建物mCherry-CcDocRK從5’到3’依次包括以下相連的元件：

(a’)修飾改造過的來自于盤狀海葵(Discosoma sea anemones)的mCherry編碼序列；

(c’)來自于梭菌纖維小體的人工迷你腳手架蛋白對接模塊Ccdockerin編碼序列。