[發(fā)明專利]利用磁珠純化提高雙特異性抗體的純度的方法在審
| 申請?zhí)枺?/td> | 201910525890.0 | 申請日： | 2019-06-18 |
| 公開（公告）號： | CN110272496A | 公開（公告）日： | 2019-09-24 |
| 發(fā)明（設(shè)計）人： | 郁博文;劉科梅;徐珊珊;王芳;陳俏梅;王卓智;李競;顧繼杰;陳智勝 | 申請（專利權(quán)）人： | 上海藥明生物技術(shù)有限公司 |
| 主分類號： | C07K16/46 | 分類號： | C07K16/46;C07K1/14 |
| 代理公司： | 上海浦一知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 31211 | 代理人： | 鄭權(quán) |
| 地址： | 200131 上海市浦東新區(qū)自由*** | 國省代碼： | 上海;31 |
| 權(quán)利要求書： | 查看更多 | 說明書： | 查看更多 |
| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 雙特異性抗體 磁珠 洗脫液 清洗 磁珠純化 磁分離 洗脫 大體積樣品 平衡緩沖液 設(shè)備需求 用水清洗 高通量 上清液 包被 孵育 活化 去除 澄清 合并 | ||
本發(fā)明公開一種利用磁珠純化提高雙特異性抗體的純度的方法，包括步驟：將經(jīng)活化的Protein A包被磁珠與待純化的含雙特異性抗體的上清液混合，孵育，待磁珠與雙特異性抗體充分結(jié)合后，通過磁分離去除上清；先用平衡緩沖液清洗磁珠，清洗2～5次；再用水清洗磁珠；將得到的清洗后的磁珠用洗脫液進行洗脫，磁分離并收集洗脫液；分離后的磁珠再用洗脫液進行洗脫1～3次，合并洗脫液，得純化后的雙特異性抗體。本發(fā)明的方法無需澄清操作，節(jié)省了時間，并減少了設(shè)備需求，可以在較短的時間內(nèi)完成更高通量、更大體積樣品的雙特異性抗體的純化。
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種利用磁珠純化提高雙特異性抗體的純度的方法。
背景技術(shù)
單克隆抗體是B淋巴細胞和骨髓瘤細胞雜交形成的雜交瘤產(chǎn)生的，其輕鏈和重鏈所形成的結(jié)構(gòu)域可以識別和結(jié)合特異抗原。至1997年FDA批準第一個治療淋巴癌的嵌合單克隆抗體上市以來，已有許多抗體藥物獲批，多個成為年銷售額超十億美元的“炸彈藥物”。雙特異性抗體是在單抗的基礎(chǔ)上通過人工工程化產(chǎn)生，可以同時識別兩個相同或不同的在抗原表位的免疫球蛋白，它的這種特點較于傳統(tǒng)單抗具有顯著的優(yōu)越性。例如，雙特異性抗體結(jié)合一個單一受體的兩個抗原表位，可以啟動針對該目標的不同抑制機制，從而顯著提升結(jié)合單一表位的能力。此外，雙特異性抗體可以同時結(jié)合兩個致病中介物(如中和兩個培基或阻礙兩個受體)，限制兩條通路，形成協(xié)同或疊加作用。其他情況下，同時標定腫瘤細胞和免疫細胞效應(yīng)物的雙特異性抗體可以有效偶聯(lián)這兩類細胞，啟動細胞毒性。Catumaxomab(Removab， Trion)于2009年正式獲得EMA批準在歐洲上市，用于治療惡性腹水(腹腔轉(zhuǎn)移癌晚期患者常見的一種并發(fā)癥)，成為全球第一個上市的雙特異性抗體。雙特異性抗體的制備主要有雙雜交瘤細胞法，化學偶聯(lián)，重組基因等方法，其中重組基因是目前使用最多的技術(shù)。
抗體藥物已成為全球生物制藥領(lǐng)域的主旋律，其迅猛發(fā)展對抗體的分離純化提出了更高的要求。抗體的純化方法通?；诓东@親和色譜，一般為Protein A，然后是離子交換/疏水/ 混合模式色譜步驟。Protein A是一種從金黃葡萄球菌細胞膜上提取的蛋白，具有5個IgG結(jié)合結(jié)構(gòu)域，能特異性地與抗體Fc端結(jié)合。利用Protein A親和純化的優(yōu)勢在于在工藝初期就能獲得高純度產(chǎn)品。現(xiàn)階段最常用的Protein A親和層析介質(zhì)是通過將ProteinA用化學偶聯(lián)的方法固定在瓊脂糖凝膠表面制成親和填料，然后裝填成層析柱。
雖然雙特異性抗體有著單抗無法比擬的優(yōu)勢，然而，由于多達四個特異性多肽鏈的共同表達或涉及延展長度的多肽鏈的組裝，IgG類雙特異性抗體的重組生產(chǎn)通常伴隨著由于重鏈同源二聚化，重鏈和輕鏈的錯配，不同鏈的不平衡的表達以及分子間的錯誤分配等導致目的物類的雜質(zhì)的增加(副產(chǎn)品或聚集體)。由于一些副產(chǎn)物展示出與目的雙抗高度的相似性，它們的去除對生產(chǎn)工藝提出了很高的挑戰(zhàn)。因此，尋找一種高效的Protein A親和純化方法，能在初步提純時提高雙特異性抗體的純度，具有重要意義。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于，提供一種雙特異性抗體的純化方法，提高雙特異性抗體的純度，相比傳統(tǒng)的層析柱具有節(jié)省時間、操作簡便、減少了設(shè)備需求等優(yōu)點。
為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種利用磁珠純化提高雙特異性抗體的純度的方法，包括步驟：
(1)結(jié)合：將經(jīng)活化的Protein A包被磁珠與待純化的含雙特異性抗體的上清液混合，孵育，待磁珠與雙特異性抗體充分結(jié)合后，通過磁分離去除上清，得到結(jié)合后的磁珠；
(2)清洗：先用平衡緩沖液清洗步驟(1)得到的磁珠，所述平衡緩沖液為0.05～0.5M Tris 緩沖液，pH 6.7～7.3，清洗2～5次；再用水清洗磁珠；
(3)洗脫：將步驟(2)得到的清洗后的磁珠用洗脫液進行洗脫，所述洗脫液為0.05～0.5M 甘氨酸溶液，pH 2.5～3.5，磁分離并收集洗脫液；分離后的磁珠再用洗脫液進行洗脫1～3次，合并洗脫液，得純化后的雙特異性抗體。
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