[發明專利]EHP和SHIV雙重實時熒光定量PCR檢測引物探針組合和試劑盒

在審

• 申請號: 201910514352.1
• 申請日: 2019-06-14
• 公開（公告）號: CN110117678A
• 公開（公告）日: 2019-08-13
• 發明（設計）人: 侯月娥;曾俊霞;陳斯娜;藍間媛;許棗珠;萬紹莉
• 申請（專利權）人: 珠海科藝普檢測科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6893;C12Q1/6851;C12Q1/06;C12N15/11;C12R1/93
• 代理公司: 北京高沃律師事務所 11569
• 代理人: 薛紅凡

本發明提供了EHP和SHIV雙重實時熒光定量PCR檢測引物探針組合和試劑盒，屬于水生動物病原檢測技術領域。所述引物探針組合采用雙重實時熒光定量PCR檢測方法，能夠一次性同時利用EHP、SHIV的專用檢測引物和探針進行兩種病原DNA的擴增。本發明提供的檢測試劑盒是一種方便、快速、檢測限低，且特異性強靈敏度高準確率高、且能同時檢測對蝦蝦肝腸胞蟲、血細胞虹彩病毒的雙重實時熒光定量PCR檢測，適用于對蝦隱性感染的早期監測。

技術領域

本發明屬于水生動物病原檢測技術領域，具體涉及EHP和SHIV雙重實時熒光定量PCR檢測引物探針組合和試劑盒。

背景技術

對蝦血細胞虹彩病毒(Shrimp Hemocyte Iridovirus，SHIV)最早由Lightner和Redman于1993年在靠近厄瓜多爾的對蝦養殖場中的原糙對蝦(Protrachypene precipuaBurkenroad)中發現的，病蝦癥狀為活力較差，肝胰腺明顯萎縮，肌肉發白，腸道發紅、斷裂，空腸空胃，鰓、步足及游泳足發黑。2017年，中科院黃海研究所科研人員在浙江嚴重死亡的南美白對蝦上發現一種新病毒，它不屬于虹彩病毒科下已建立的五個屬，根據蝦感染該病毒后的臨床癥狀和病理癥狀，命名為蝦血細胞虹彩病毒(SHIV)。而蝦肝腸胞蟲(Enterocytozoon hepatopenaei，EHP)是現階段養殖對蝦特別是南美白對蝦的最大威脅，SHIV和EHP是我國對蝦養殖過程中兩種新發疫病，前者導致蝦大量的死亡，后者導致對蝦生長緩慢，參差不齊，甚至生長停滯，僅偶爾伴隨有白便或者在應激條件下才出現大量死亡，所以養殖投入高結果收獲甚微，給養殖業造成巨大的經濟損失。

目前，對蝦病害種類較多，診斷手段主要包括病理學和生物學方法、免疫診斷法分子雜交、電鏡觀察及PCR技術。已建立的常規PCR技術，多是一次檢測一種病原，檢測耗時較長，檢測靈敏度和準確性有待進一步提高。

發明內容

有鑒于此，本發明的目的在于提供一種EHP和SHIV雙重實時熒光定量PCR檢測引物探針組合和試劑盒，不僅可以同時檢測EHP和SHIV兩種病原，而且檢測靈敏度高、準確性好。

本發明提供的一種EHP和SHIV雙重實時熒光定量PCR檢測引物探針組合，包括檢測EHP的引物探針組合和檢測SHIV的引物探針組合；

所述檢測EHP的引物探針組合包括如SEQ ID No.1所示的正向引物EHP-F、如SEQID No.2所示的反向引物EHP-R和如SEQ ID No.3所示的探針EHP-Pro；

所述檢測SHIV的引物探針組合包括如SEQ ID No.4所示的正向引物SHIV-F、如SEQID No.5所示的反向引物SHIV-R和如SEQ ID No.6所示的探針SHIV-Pro。

本發明提供了所述的引物探針組合在制備EHP和SHIV雙重實時熒光定量PCR檢測試劑中的應用。

本發明提供了一種EHP和SHIV雙重實時熒光定量PCR檢測試劑盒，包括所述引物探針組合。

優選的，還包括qPCR Probe MasterMix。

優選的，在同一檢測體系中，SHIV-F或SHIV-R的終濃度獨立為0.4pmol/μL，SHIV-Pro的終濃度為0.2pmol/μL，EHP-F或EHP-R的終濃度獨立為0.35pmol/μL，EHP-Pro的終濃度為0.25pmol/μL。

優選的，用于檢測EHP和SHIV雙重實時熒光定量PCR的擴增程序如下：95℃預變性5min；95℃變性10s，退火溫度60℃30s，共40個循環，每個循環結束時進行熒光信號采集。