[發明專利]一種可即時偵測一種以上螢光訊號的聚合酶鏈式反應裝置

在審

• 申請號: 201910510609.6
• 申請日: 2019-06-13
• 公開（公告）號: CN112080414A
• 公開（公告）日: 2020-12-15
• 發明（設計）人: 賴盈達;歐育誠;吳俊德;黃瑜雯;陳翰毅
• 申請（專利權）人: 克雷多生物醫學私人有限公司
• 主分類號: C12M1/38
• 分類號: C12M1/38;C12M1/00
• 代理公司: 北京律盟知識產權代理有限責任公司 11287
• 代理人: 劉鋒

本發明涉及一種可即時偵測一種以上螢光訊號的聚合酶鏈式反應裝置。本裝置是透過控制試劑容器容置空間的升降溫區間以進行聚合酶鏈式反應，并透過加入專一性探針、螢光物質、光源、以及光譜儀來偵測產生的螢光訊號。同時，本裝置亦預載一演算法用以即時分析并定量螢光訊號。

技術領域

本發明涉及一種聚合酶鏈式反應的裝置。更具體的，本發明更涉及一種可即時定量一個以上螢光訊號的聚合酶鏈式反應裝置。

背景技術

聚合酶鏈式反應(Polymerase Chain Reaction，以下簡稱PCR)為一種快速放大DNA訊號的技術，其原理及主要操作步驟為(a)變性(denature)：利用高溫(90-95℃)將雙股DNA解離成單股DNA，再以單股DNA作為復制的模板；(b)引物黏合(primer annealing)：溫度降低到適當溫度時，引物會黏附到正確的目標基因位置；(c)引物延長(primerextension)：反應溫度修正到72℃，DNA聚合酶將脫氧核糖核苷三磷酸(deoxy-ribonucleotide triphosphate，以下簡稱dNTPs)逐次黏附于引物后，合成另一股新DNA片段。

透過變性-引物黏合-引物延長三個步驟不斷重復進行核酸訊號放大，每重復一次三個步驟的操作，目標基因的數目就可擴增一倍，若設定三個步驟操作共進行40次循環，目標基因的數量就可以放大近10⁹倍，PCR可體外大量獲得目標基因片段，因此做為目前臨床診斷大量使用的分子診斷技術之一，可應用于包含遺傳疾病診斷、病原菌診斷、腫瘤癌癥的診斷預后評估、以及基礎研究等項目，因此同樣作為目前被臨床診斷大量運用的技術。

近年來因應技術發展需求，開發出即時聚合酶鏈鎖反應(Real-time polymerasechain reaction)，又稱定量即時聚合酶鏈鎖反應(Quantitative real-time polymerasechain reaction，簡稱為Q-PCR)(本文以下皆稱為real-time PCR)。Real-time PCR和傳統PCR雖然都是利用熱循環步驟使目標基因的微量DNA進行擴增達到放大的目的，但二者不同的是，Real-time PCR是透過加入非專一性的螢光物質或具專一性的螢光探針于PCR反應中，透過每一次PCR擴增循環后，目標基因DNA放大的同時亦產生螢光訊號，偵測并記錄其生成產物的螢光訊號，待PCR反應完成后，以cycle number和螢光訊號作圖，可得到一反應曲線圖形，完整呈現PCR反應中每一次循環的產物生成情形，再透過內建程式分析以達到即時定量的結果。

目前常用的非專一性的螢光染料為SYBR Green 1，其與DNA的次溝槽(minorgroove)結合后釋放出螢光，因此在PCR過程中可在每一次循環的引物延長步驟結束時測量螢光強度，就可知每一次循環中產生了多少PCR產物。但由于SYBR Green I會跟所有的雙股DNA結合，所以無法分辨特異性產物與非特異性產物，因此其對于產物的專一性較差，有時候會出現偽陽性的測驗結果。

而目前常用的專一性的螢光探針則為TaqMan probe，其為一人工合成的寡核甘酸(oligonucleotide)，具有對目標基因序列的專一性，并在寡核甘酸的兩端分別標記上不同的螢光物質，5’端螢光稱為信息基團(reporter)而3’端螢光稱淬滅體(quencher)。假如所述專一性探針在游離狀態時，信息基團及淬滅體的交互作用會互相遮蔽對方的螢光，因此不會有螢光產生；但當PCR產物生成時，所述專一性探針被水解后，淬滅體就失去可以遮蔽淬滅體的效果，因此reporter的螢光即可被偵測到。由于所述專一性探針是唯一針對目標基因具有特異性的寡核甘酸，因此不會與其他非特異性產物結合。目前實務上常與TaqManprobe合并使用的螢光染劑包含FAM、VIC、HEX、ROX、CY3、CY5、CY5.5、JOE、TET、Texas Red、TAMRO、NED、Quasar705、Alexa488、Alexa546、Alexa594、Alexa633、Alexa643、Alexa680。