[發(fā)明專利]一種檢測(cè)雌激素受體的電化學(xué)傳感器及其應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201910510316.8
• 申請(qǐng)日: 2019-06-13
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN110243906B
• 公開(kāi)（公告）日: 2021-09-03
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李金龍;張永臣;胡亮;許傳軍;胡凱;張兆利
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 南京市第二醫(yī)院;南京鼓樓醫(yī)院
• 主分類號(hào): G01N27/327
• 分類號(hào): G01N27/327;G01N27/38;G01N27/48
• 代理公司: 南京瑞弘專利商標(biāo)事務(wù)所(普通合伙) 32249
• 代理人: 馮慧

1. 一種檢測(cè)雌激素受體的電化學(xué)傳感器，其特征在于:該檢測(cè)器基于3’-平末性DNAY-結(jié)構(gòu)，在雌激素受體存在下，它能與修飾在電極表面的DNA Y-結(jié)構(gòu)中的DNA特異性結(jié)合，使DNA不受外切酶III降解的影響，由于DNA Y-結(jié)構(gòu)中含有G-四聯(lián)體，在電極上加入血紅素后，形成具有辣根過(guò)氧化物酶樣活性的DNA模擬酶，會(huì)產(chǎn)生明顯的電化學(xué)信號(hào)，從而實(shí)現(xiàn)了雌激素受體的定量檢測(cè)；

其中，3’-平末性DNA Y-結(jié)構(gòu)具體如下所示：

。

2.一種如權(quán)利要求1所述的電化學(xué)傳感器的制備方法，其特征在于，具體包括如下步驟：

(1)金電極預(yù)處理；

(2)將5-20μL含有0.2μM P1的DNA固定液滴定在預(yù)處理的金電極表面，在4℃條件下，孵育8-16小時(shí)，P1通過(guò)Au-S鍵組裝在電極表面；

（3）金電極進(jìn)一步用1 mM MCH溶液處理10-50分鐘，然后用DNA雜交緩沖液沖洗；

(4)在37℃下，將含有1μM P3和1μM P2的DNA雜交緩沖液滴加在金電極表面1-3h，雜交后，用去離子水徹底沖洗電極，即可制得電化學(xué)傳感器。

3.如權(quán)利要求2所述的電化學(xué)傳感器的制備方法，步驟（1）金電極預(yù)處理，具體包括如下步驟：

a)金電極用氧化鋁粉末拋光，得到拋光后的電極；

b)將步驟a)中拋光后的電極浸泡在水虎魚溶液中2-20min消除吸附的有機(jī)物，并用去離子水徹底清洗；

c)再將電極用50%硝酸浸泡10-30min，然后分別用乙醇和去離子水處理電極2-8min，再用氮?dú)獯蹈珊螅瑢㈦姌O浸入0.5 M硫酸中，用循環(huán)伏安法從0到1.6V進(jìn)行掃描直到獲得穩(wěn)定的信號(hào)。

4.如權(quán)利要求2所述的電化學(xué)傳感器的制備方法，其特征在于：

步驟（2）中DNA固定液的用量為10μL；

步驟（3）中的處理金電極的時(shí)間為30分鐘；

步驟（4）DNA雜交緩沖液中P3和P2的濃度比為1：1；

步驟（4）中DNA雜交緩沖液的用量為10μL。

5.如權(quán)利要求3所述的電化學(xué)傳感器的制備方法，步驟b)中的水虎魚溶液具體為V(H₂SO₄)：(30% H₂O₂)= 3：1。

6.如權(quán)利要求1所述的電化學(xué)傳感器或權(quán)利要求2所述的電化學(xué)傳感器的制備方法在檢測(cè)雌激素受體方面的應(yīng)用，具體步驟如下：

（1）將DNA Y結(jié)構(gòu)修飾的金電極浸入含有雌激素受體的50-300μL DNA結(jié)合緩沖液中37℃浸泡50-100分鐘；

（2）用PBS對(duì)電極進(jìn)行徹底沖洗，并浸入30-80μl含有2U外切酶III的NE緩沖液I中，37℃孵育10-50分鐘，然后，加入20mm EDTA以終止外切酶III反應(yīng)后，用PBS緩沖液和去離子水對(duì)電極進(jìn)行沖洗；

（3）在室溫下將10μl新制備的含25 mM HEPEs、100μM氯化血紅素、200 mM NaCl、12.5mM MgCl2和50 mM KCl的氯化血紅素溶液滴到電極表面0.5-2 h，隨后，使用電極進(jìn)行測(cè)量；

（4）電化學(xué)檢測(cè)：電化學(xué)阻抗譜（EIS）在5.0 m M的[Fe（CN）₆]^3-/4-含0.1M KCl中進(jìn)行，頻率在10^-1至10⁵ Hz范圍內(nèi)，在含有1.0 mM H₂O₂和0.2 mM HQ的5 ml 濃度為0.1M pH 7.4 的PBS中進(jìn)行差分脈沖伏安法，掃描范圍為-0.2至0.2 v。

7.如權(quán)利要求6中的應(yīng)用，其特征在于：

步驟（1）中DNA結(jié)合緩沖液的體積為150μL；

步驟（1）中浸泡時(shí)間為30分鐘；

步驟（2）中，NE緩沖液I的體積為50μL。