[發(fā)明專利]一種檢測(cè)雌激素受體的電化學(xué)傳感器及其應(yīng)用有效
| 申請(qǐng)?zhí)枺?/td> | 201910510316.8 | 申請(qǐng)日: | 2019-06-13 |
| 公開(kāi)(公告)號(hào): | CN110243906B | 公開(kāi)(公告)日: | 2021-09-03 |
| 發(fā)明(設(shè)計(jì))人: | 李金龍;張永臣;胡亮;許傳軍;胡凱;張兆利 | 申請(qǐng)(專利權(quán))人: | 南京市第二醫(yī)院;南京鼓樓醫(yī)院 |
| 主分類號(hào): | G01N27/327 | 分類號(hào): | G01N27/327;G01N27/38;G01N27/48 |
| 代理公司: | 南京瑞弘專利商標(biāo)事務(wù)所(普通合伙) 32249 | 代理人: | 馮慧 |
| 地址: | 210003 *** | 國(guó)省代碼: | 江蘇;32 |
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| 摘要: | |||
| 搜索關(guān)鍵詞: | 一種 檢測(cè) 雌激素 受體 電化學(xué)傳感器 及其 應(yīng)用 | ||
1. 一種檢測(cè)雌激素受體的電化學(xué)傳感器,其特征在于:該檢測(cè)器基于3’-平末性DNAY-結(jié)構(gòu),在雌激素受體存在下,它能與修飾在電極表面的DNA Y-結(jié)構(gòu)中的DNA特異性結(jié)合,使DNA不受外切酶III降解的影響,由于DNA Y-結(jié)構(gòu)中含有G-四聯(lián)體,在電極上加入血紅素后,形成具有辣根過(guò)氧化物酶樣活性的DNA模擬酶,會(huì)產(chǎn)生明顯的電化學(xué)信號(hào),從而實(shí)現(xiàn)了雌激素受體的定量檢測(cè);
其中,3’-平末性DNA Y-結(jié)構(gòu)具體如下所示:
。
2.一種如權(quán)利要求1所述的電化學(xué)傳感器的制備方法,其特征在于,具體包括如下步驟:
(1)金電極預(yù)處理;
(2)將5-20μL含有0.2μM P1的DNA固定液滴定在預(yù)處理的金電極表面,在4℃條件下,孵育8-16小時(shí),P1通過(guò)Au-S鍵組裝在電極表面;
(3)金電極進(jìn)一步用1 mM MCH溶液處理10-50分鐘,然后用DNA雜交緩沖液沖洗;
(4)在37℃下,將含有1μM P3和1μM P2的DNA雜交緩沖液滴加在金電極表面1-3h,雜交后,用去離子水徹底沖洗電極,即可制得電化學(xué)傳感器。
3.如權(quán)利要求2所述的電化學(xué)傳感器的制備方法,步驟(1)金電極預(yù)處理,具體包括如下步驟:
a)金電極用氧化鋁粉末拋光,得到拋光后的電極;
b)將步驟a)中拋光后的電極浸泡在水虎魚溶液中2-20min消除吸附的有機(jī)物,并用去離子水徹底清洗;
c)再將電極用50%硝酸浸泡10-30min,然后分別用乙醇和去離子水處理電極2-8min,再用氮?dú)獯蹈珊螅瑢㈦姌O浸入0.5 M硫酸中,用循環(huán)伏安法從0到1.6V進(jìn)行掃描直到獲得穩(wěn)定的信號(hào)。
4.如權(quán)利要求2所述的電化學(xué)傳感器的制備方法,其特征在于:
步驟(2)中DNA固定液的用量為10μL;
步驟(3)中的處理金電極的時(shí)間為30分鐘;
步驟(4)DNA雜交緩沖液中P3和P2的濃度比為1:1;
步驟(4)中DNA雜交緩沖液的用量為10μL。
5.如權(quán)利要求3所述的電化學(xué)傳感器的制備方法,步驟b)中的水虎魚溶液具體為V(H2SO4):(30% H2O2)= 3:1。
6.如權(quán)利要求1所述的電化學(xué)傳感器或權(quán)利要求2所述的電化學(xué)傳感器的制備方法在檢測(cè)雌激素受體方面的應(yīng)用,具體步驟如下:
(1)將DNA Y結(jié)構(gòu)修飾的金電極浸入含有雌激素受體的50-300μL DNA結(jié)合緩沖液中37℃浸泡50-100分鐘;
(2)用PBS對(duì)電極進(jìn)行徹底沖洗,并浸入30-80μl含有2U外切酶III的NE緩沖液I中,37℃孵育10-50分鐘,然后,加入20mm EDTA以終止外切酶III反應(yīng)后,用PBS緩沖液和去離子水對(duì)電極進(jìn)行沖洗;
(3)在室溫下將10μl新制備的含25 mM HEPEs、100μM氯化血紅素、200 mM NaCl、12.5mM MgCl2和50 mM KCl的氯化血紅素溶液滴到電極表面0.5-2 h,隨后,使用電極進(jìn)行測(cè)量;
(4)電化學(xué)檢測(cè):電化學(xué)阻抗譜(EIS)在5.0 m M的[Fe(CN)6]3-/4-含0.1M KCl中進(jìn)行,頻率在10-1至105 Hz范圍內(nèi),在含有1.0 mM H2O2和0.2 mM HQ的5 ml 濃度為0.1M pH 7.4 的PBS中進(jìn)行差分脈沖伏安法,掃描范圍為-0.2至0.2 v。
7.如權(quán)利要求6中的應(yīng)用,其特征在于:
步驟(1)中DNA結(jié)合緩沖液的體積為150μL;
步驟(1)中浸泡時(shí)間為30分鐘;
步驟(2)中,NE緩沖液I的體積為50μL。
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