[發明專利]結合Cry1Da蛋白的多肽分子及其應用

有效

• 申請號: 201910508465.0
• 申請日: 2019-06-12
• 公開（公告）號: CN110283232B
• 公開（公告）日: 2021-01-05
• 發明（設計）人: 何慶華;游凱豪;危泰龍
• 申請（專利權）人: 江西中藻生物科技股份有限公司
• 主分類號: C07K7/06
• 分類號: C07K7/06;C12N15/11;G01N33/68
• 代理公司: 廣州藍晟專利代理事務所(普通合伙) 44452
• 代理人: 楊曉冰

本發明涉及生物技術領域，具體涉及結合Cry1Da蛋白的多肽分子及其應用，通過以Cry1Da蛋白為靶分子，投入噬菌體隨機展示肽庫，通過獨特的負篩、緩沖液、包被時間、競爭物洗脫等親和淘選條件，獲得了一種可特異性結合Cry1Da蛋白的多肽分子，其氨基酸序列為：PTAVGGS。本發明所提及的多肽分子可替代傳統的Cry1Da抗體分子，作為Cry1Da的結合分子直接應用于免疫學檢測分析，該多肽分子特異性強、結合性能高、結構穩定性、耐酸堿，制備簡單快速等特點。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及結合Cry1Da蛋白的多肽分子及其應用。

背景技術

蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis，Bt)蛋白是一種廣泛存在于土壤中的革蘭氏陽性細菌所分泌的一種伴孢晶體內含物，對各類的靶昆蟲具有殺蟲活性，被稱為殺蟲晶體蛋白(ICP，Insecticidal Crystal Protein)，又稱為δ-內毒素或Bt毒蛋白，是目前市面上Bt殺蟲劑的主要成分。它以原毒素形式被目標昆蟲攝入后，在昆蟲中腸堿性環境中被特異蛋白酶水解，生成能耐受蛋白酶作用的蛋白。激活后的蛋白首先與中腸細胞膜上的特異性受體結合，然后插入到細胞膜中，形成溶解性孔洞，造成細胞釋放其內含物，最終導致昆蟲死亡。另外，Bt蛋白的抗蟲轉基因作物也已經推廣至全球并取得很好的殺蟲效果。Bt蛋白的種類有很多種，根據編碼蛋白的殺蟲譜和編碼基因序列的同源性，可將Bt蛋白分為兩大類：分別是晶體蛋白家族(Crystal protein，Cry)和細胞溶解蛋白家族(Cytolyticprotein，Cyt)。其中的Cry基因又被分為4個類群，即Cry1、Cry2、Cry3、Cry4；根據氨基酸的同源性大小，在Cry1基因的基礎上進一步分類為：Cry1A、Cry1B、Cry1C、Cry1D。伴隨轉基因作物的全球化，人們開始對轉基因作物的安全性產生顧慮，而作為殺蟲劑市場占有率最高的Bt蛋白，是否對人類存在威脅也越來越受到世界各國的關注。因此，對轉基因食品中Bt蛋白的檢測具有重要意義。

目前對于Bt蛋白的檢測主要依靠免疫學分析，其中以酶聯免疫吸附法(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA)尤其是雙抗夾心ELISA最為常見。在雙抗夾心ELISA中，抗原經過兩種抗體(捕獲抗體和檢測抗體)的特異性選擇，使這種方法的特異性和靈敏度都非常高。

免疫學分析方法的核心在于抗原-抗體間的特異性識別及結合，因此制備特異性結合抗原的抗體就成為發展免疫學分析方法的前提與核心。抗體的研究近年來發展迅猛，已經從傳統的多克隆、單克隆抗體，發展至以單鏈抗體、噬菌體展示抗體、單域重鏈抗體、抗獨特型抗體等為代表的基因工程抗體領域。相比于傳統抗體制備必須經歷動物免疫、細胞融合、陽性克隆篩選等復雜程序，基因工程抗體以其可定向改造、淘選方便等優點已成為目前研究的熱點。除此以外，近年來包括我國在內的眾多學者已經開始著眼于不以免疫球蛋白為主體組成結構的新型抗體研究，例如基于SELEX技術的核酸適配體、基于分子印跡聚合體技術的人工抗體以及基于Lipocalin蛋白家族的抗體類似物等都取得了可喜的進展，為傳統抗體的替代性研究提供了扎實的理論和方法學基礎。縱觀抗體的發展動態，可以看出新型抗體具有分子量小、結構簡單、可自我進化、制備快捷的特點及發展趨勢。例如，單克隆抗體、單鏈抗體、單域重鏈抗體的分子量逐漸減少，分別為150、30-50、15-20kDa，以Lipocalin為骨架蛋白的抗體類似物為18-20kDa，而核酸適配體則僅為一小段核酸序列。

近年來人們熱衷于研究發展肽模擬物，目的之一是將具有生物活性的復雜分子逐步修飾、取代、改造、最終壓縮至僅包含功能單位的小分子，稱之為肽模擬物的合理設計。因此，多肽分子可成為潛在的新型抗體分子。隨著噬菌體展示多肽庫技術的迅速發展，通過噬菌體展示肽庫的淘選，無需動物免疫過程即可快速、簡單地獲得與特定靶體分子特異性結合的多肽分子。噬菌體展示肽庫技術的主要特點是可有效地篩選出與目標靶體特異結合的噬菌體展示多肽，該技術在探索受體與配體之間相互作用結合位點、尋求高親和力生物活性的配體分子、探索未知蛋白質空間結構表位、新型疫苗的研制等方面應用廣泛。