[發明專利]一種甘薯黑斑病菌的LAMP檢測引物及其應用

在審

• 申請號: 201910505934.3
• 申請日: 2019-06-12
• 公開（公告）號: CN110093450A
• 公開（公告）日: 2019-08-06
• 發明（設計）人: 王榮波;陳慶河;劉裴清;李本金;翁啟勇
• 申請（專利權）人: 福建省農業科學院植物保護研究所
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/6844;C12Q1/04;C12N15/11;C12R1/645
• 代理公司: 福州元創專利商標代理有限公司 35100
• 代理人: 饒文君;蔡學俊

1.一種甘薯黑斑病菌的LAMP檢測引物，其特征在于：所述LAMP檢測引物包括2條外引物F3 和 B3，以及 2條內引物 FIP 和 BIP，引物序列分別為：

F3：5'-CCAGGCACACGAGTCAGT-3'，

B3：5'-TCCTCCTTGGACTTGATCGA-3'；

FIP：5'-CGTCACAGGGTGCAGAGCAGGTGTACATCAGTGGCGCTAT-3'，

BIP：5'-TGCTGCGCCACGAACACAAGTGGGTATTCGGAGCTGAGAT-3'。

2.一種利用權利要求1所述甘薯黑斑病菌的LAMP檢測引物進行LAMP反應檢測甘薯黑斑病菌的方法，其特征在于，包括以下步驟：

（1）待檢測樣品基因組DNA 的提?。?/p>

（2）LAMP檢測反應體系：以步驟（1）提取的DNA為模板，利用F3/B3，FIP /BIP 引物進行擴增;

反應體系為25 μl，包含20 mM Tris-HCl，10 mM (NH₄)₂SO₄，10 mM KCl，8 mM MgSO₄，甜菜堿0.8 mol/L，Bst 聚合酶為8 U，dNTPs 1.0 mmol/L，F3和B3各 0.2 mmol/L，FIP和BIP各1.6 mmol/L，鈣黃綠素50 μmol/L，氯化錳500 μmol/L，TWeen-20 0.1%，模板DNA 50~100ng，無菌雙蒸水補足至25 μl；

（3）LAMP反應：步驟（2）的反應體系在64℃溫育60 min，85℃滅活10 min；

（4）結果檢測：以熒光染料目測觀察法和瓊脂糖凝膠電泳法進行檢測；

熒光染料目測觀察法：在LAMP反應后，反應液顯色結果觀察到綠色熒光判斷為陽性，橙色判斷為陰性；

瓊脂糖凝膠電泳法：取2 μl LAMP反應產物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，出現LAMP特征性的梯形條帶則判斷為陽性，沒有出現擴增條帶則判斷為陰性。

3.如權利要求1所述的甘薯黑斑病菌的LAMP檢測引物在甘薯黑斑病菌的診斷、檢測、鑒定中的應用。

4.如權利要求2所述的甘薯黑斑病菌的LAMP檢測引物進行LAMP反應檢測甘薯黑斑病菌的方法在甘薯黑斑病菌的診斷、檢測、鑒定中的應用。