[發明專利]用于上調人DLK1-DIO3印記域非編碼RNA表達的sgRNA、重組質粒和細胞株

有效

• 申請號: 201910496685.6
• 申請日: 2019-06-10
• 公開（公告）號: CN110305863B
• 公開（公告）日: 2020-12-08
• 發明（設計）人: 徐鑫;鄭祥義;王瀟;陳世明;李江楓;顏華卿
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/63;C12N5/10;C12R1/91
• 代理公司: 杭州求是專利事務所有限公司 33200
• 代理人: 林超

本發明公開了一種用于上調人DLK1?DIO3印記域非編碼RNA表達的sgRNA、重組質粒和細胞株。sgRNA序列如SEQ ID NO.1，具體為5’?TTTATATGGAGGCGCAGAAG?3’；方法合成為，合成sgRNA序列的核酸片段并插入到MS2?P65?HSF1表達質粒載體的多克隆位點并轉化，選擇單克隆菌株，提取MS2?P65?HSF1?sgRNA?DLK1?DIO3重組質粒，將重組質粒轉染到已預先轉染dCAS9?VP64質粒的目的細胞株，得到上調DLK1?DIO3印記域非編碼RNA表達的細胞株。本發明能快速、簡便、準確上調細胞株中DLK1?DIO3印記域上非編碼RNA的表達。

技術領域

本發明涉及基因編輯及其應用，特別涉及用于上調DLK1-DIO3印記域非編碼RNA表達的專用sgRNA引物序列及其應用。

技術背景

基因編輯技術是近年來發展起來的一項基因組修飾技術，可在基因組特定位點進行InDel突變、敲入、多位點突變、小片段刪除、以及片段替換等操作。在科學研究領域，基因編輯技術可用于模式生物的快速構建，如特定基因敲除小鼠的構建；在農業領域，該技術可用于動植物品種的優化改造；而在醫療衛生領域，該技術還有可能通過改造人類自身基因，從源頭上治療疾病的目的。因此，基因編輯技術具有極其廣泛的應用價值和發展前景。

CRISPR/Cas屬于第三代基因編輯技術，其來源于天然存在的原核生物適應性免疫系統。2012年8月，美國加州大學伯克利分校和德國漢諾威醫學院的研究人員在《Science》雜志上發表文章，首先報道了該系統的工作原理，其主要可通過向導RNA序列(即sgRNA)的引導來實現對特定基因的編輯。CRISPR/Cas系統經過多年發展，可實現多個哺乳動物系統內高效可靠的RNA導向基因組修飾，從而大幅提高了基因組編輯以及基因組調控的便捷程度。最初發表的有關CRISPR系統的文章，介紹的全都是如何利用CRISPR系統切割DNA的工作。Qi和Jaenisch等人最近構造了一個融合激活蛋白(VP48、VP64、VP96、p65)的無核酸酶活性Cas9蛋白(dCas9-VP64)，通過sgRNA靶向基因啟動子序列，激活蛋白募集轉錄因子，從而可以增強下游靶基因的表達。Jaenisch等將此技術命名為“CRISPR-on”技術(www.crispr-on.org)。

DLK1-DIO3印記域非編碼RNA和腫瘤的發生與進展有關，特別是母系表達印記基因(主要是非編碼RNA:如miRNAs和少量一些lncRNAs)。這些非編碼RNA的轉錄方向一致，且具有共同的印記調控區基因間DMR(IG-DMR)。在已有的研究中，大多數報道均提示DLK1-DIO3印記域的非編碼RNA在腫瘤中的表達受到抑制，提示其可能發揮抑癌作用。因此能夠利用CRISPR-on系統全面上調它們的轉錄和表達，其關鍵在于sgRNA設計和有效性。

發明內容

為了解決背景技術中存在的問題，本發明目的為利用CRISPR-on技術，鑒于DLK1-DIO3印記域的非編碼RNA的成簇分布和同時轉錄的特征，提供設計了一種針對DLK1-DIO3印記域的特異性sgRNA序列，能快速、簡便、準確上調細胞株中DLK1-DIO3印記域上非編碼RNA的表達，可進一步利用CRISPR-on系統全面上調它們的轉錄和表達。本發明的另一目的為提供了一種MS2-P65-HSF1-sgRNA-DLK1-DIO3重組質粒。本發明還提供了上調DLK1-DIO3印記域上非編碼RNA表達的細胞株。

本發明的技術方案如下：

一、一種針對DLK1-DIO3印記域啟動子區設計的sgRNA序列：序列如SEQ ID NO.1，具體為5’-TTTATATGGAGGCGCAGAAG-3’，這一sgRNA命名為sgRNA(DLK1-DIO3)。定位于DLK1-DIO3印記域上非編碼RNA轉錄起始位點上游-32～-13，長度為20nt。