[發明專利]細胞培養基及使用其的培養方法

有效

• 申請號: 201910496491.6
• 申請日: 2014-11-21
• 公開（公告）號: CN110283774B
• 公開（公告）日: 2023-06-09
• 發明（設計）人: 加藤智久;金村米博;正札智子;福角勇人
• 申請（專利權）人: 株式會社鐘化;獨立行政法人國立病院機構
• 主分類號: C12N5/00
• 分類號: C12N5/00;C12N5/074
• 代理公司: 北京市柳沈律師事務所 11105
• 代理人: 沈雪

本發明的課題在于提供一種不使用飼養細胞而能夠提高細胞的增殖效率的細胞培養基，特別是提供一種不含血清的細胞培養基。根據本發明，可以提供一種含有生長停滯特異性蛋白質6(Growth?arrest?specific?6；GAS6)且不含血清的細胞培養基。

本申請是申請日為2014年11月21日、申請號為201480063892.8、發明名稱為“細胞培養基及使用其的培養方法”的申請的分案申請。

技術領域

本發明涉及細胞培養基及細胞的培養方法。進而，本發明還涉及可以在上述培養方法中使用的飼養細胞、以及對用于培養細胞的培養基進行評價的方法。

背景技術

通過近年來的研究，人ES細胞(hESC)或人iPS細胞(hiPSC)等人多能干細胞在再生醫療領域中實用化的可能性正在增高。這些多能干細胞具有能夠無限增殖的能力和分化成各種細胞的能力，作為對疑難疾病、生活習慣病等的治療方法而備受期待。人多能干細胞顯示出能在試管內分化誘導成神經細胞、心肌細胞、血液細胞或網膜細胞等多種細胞。

飼養細胞起到將用于維持培養人多能干細胞的生長因子供給于干細胞的作用。因此，一直以來，hESC、hiPSC等人多能干細胞的培養主要在源自小鼠的飼養細胞(MEF：mouseembryonic?fibroblast)層上進行。作為能夠維持培養人多能干細胞的活性，報告了各種人細胞瘤(非專利文獻1～4)。然而，使用源自小鼠的飼養細胞的方法由于會在人多能干細胞中混入飼養細胞，因此在對生物體的安全性上存在問題。另外，對于使用源自人的飼養細胞的培養方法而言，存在培養時花費功夫制備飼養細胞的問題。

作為不使用MEF等飼養細胞而培養人多能干細胞的方法，已知事先用MEF對培養基進行馴化的方法(MEF-CM)、將MEF進行化學性固定的方法(非專利文獻5)。另外，還報告了不使用異種細胞而使用成纖維細胞、胎盤細胞、骨髓細胞、子宮內膜細胞等各種源自人的細胞作為活飼養細胞的方法(非專利文獻6)。進而，為了培養人多能干細胞，還可以使用含有牛血清、KNOCKOUT^TM?SR(Knockout?Serum?Replacement：通過作為替代血清使用而能夠培養ES/iPS細胞的添加劑)等的培養基。但是，這些多是添加了從牛血清提取出的蛋白質而制成的培養基，存在牛海綿狀腦病(BSE)等傳染病、病毒導致的細胞污染的隱患。雖然有時使用源自人的血清，但是由于在使用上存在限制、制約，因此是不實用的。另外，已知用MEF對這些含有血清或血清代替物的人多能干細胞用培養基進行馴化而得到的培養基能夠實現人多能干細胞的無飼養細胞培養。然而，在含有大量的源自血清的蛋白質的培養基中，難以對由MEF分泌的對人多能干細胞的增殖有益的因子進行鑒定。為了鑒定上述因子，還對用MEF-CM培養的人ES細胞中發生特異性改變的受體蛋白質進行了分析(非專利文獻7)。

另外，為了不使用MEF進行培養，正在推進規定化學成分(ケミカルデファインド)培養基的開發，也能夠避免混入源自牛血清的成分的問題(非專利文獻8及9)。還正在進行從MEF的分泌物分析功能性蛋白質(非專利文獻10)。另外，還報告了通過添加玻璃體結合蛋白：IGF1嵌合蛋白質(chimeric?protein)而不使用飼養細胞地培養胚性干細胞(非專利文獻11)。作為含有IGF的市售培養基，已知有STEM?CELL?Technologies公司的mTeSR1(注冊商標)、Life?Technologies公司的STEMPRO(注冊商標)等。但是，對于人多能干細胞的培養而言，仍然存在無法穩定地培養、增殖性較差的課題。