[發明專利]CRISPR/Cas9系統介導的山羊KRTAP13-1基因敲除的方法

在審

• 申請號: 201910495313.1
• 申請日: 2019-06-11
• 公開（公告）號: CN110172478A
• 公開（公告）日: 2019-08-27
• 發明（設計）人: 劉東軍;高源;郝斐;呼嘯;多磊
• 申請（專利權）人: 內蒙古大學
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N15/90;C12N5/10;C12N15/877;A01K67/027
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本發明利用CRISPR/Cas9系統介導完成山羊KRTAP13?1基因定點敲除，本研究依據山羊的KRTAP13?1基因序列，構建基于CRISPER/Cas9系統的Cas9/gRNA打靶載體；然后將優化后的Cas9/gRNA共表達敲除載體轉染至山羊胎兒成纖維細胞中，獲得KRTAP13?1基因定點敲除的細胞株。本發明所構建的基于CRISPER/Cas9系統的敲除載體為山羊KRTAP13?1基因定點敲除提供了一種簡單快捷安全的途徑。該方法在細胞株篩選過程中沒有涉及任何篩選標記基因，從而大大提高了轉基因動物的安全性，對山羊的基因功能以及遺傳育種的研究具有重要價值。

技術領域

本發明涉及分子生物學及動物遺傳育種領域，具體地說，涉及 CRISPR/Cas9技術介導的山羊KRTAP13-1基因定點敲除的方法。

背景技術

在目前的生命科學領域內，CRISPR/Cas系統作為第三代基因編輯工具展現出巨大的潛力和前所未有的影響力。在動物學、植物學和醫學等領域都引起了巨大的變革，也得到了充分的肯定。在CRISPR/Cas 系統出現之前，對于基因的定點修飾作用主要通過鋅指核酸酶(ZFN) 和轉錄激活因子效應物(TALE)實現。但這兩項技術僅限于某些模式生物并且效率較低，還需要對每個靶位點進行復雜的蛋白質工程，這也大大增加了實驗難度和成本。CRISPR/Cas9系統不同于第一代的ZFN 和第二代的TALE技術，它是一種使用互補RNA引導序列實現對目標位點精準識別的基因編輯過程，而且Cas9蛋白是一類不需要與其他蛋白質融合表達的核酸酶，只需要合成與靶序列互補的引導RNA分子就可以編輯幾乎所有的基因位點。正是由于這種特性，大大簡化了實驗設計難度，使得基因編輯技術得到了前所未有的廣泛應用。

內蒙古白絨山羊是我國特有的優秀山羊品種，有著飼養簡單、育成時間短、絨肉兼用等特點，主要分布于內蒙古西部地區，是目前世界上產絨量最高、絨纖維品質最好的山羊品種。其產絨量約占中國的一半以上，占世界羊絨產量的1/3。而山羊絨作為絨山羊最重要的經濟組成部分，是由山羊次級毛囊生長的珍貴絨毛纖維，又因為產量稀少導致價格十分昂貴。其中衡量羊絨品質和經濟價值的核心指標就是羊絨細度。但目前在羊絨產業中對羊絨細度性狀的維持和保護卻遠遠不夠。故培育超細絨型的絨山羊新品系顯得十分重要。相對于傳統育種，現代生物技術極大程度地縮短了育種所需時間，農業生物新品種培育提供了新的技術途徑。

角蛋白是生物體內一種重要的結構蛋白，是毛發等皮膚衍生物的主要組成成分，對毛囊發育與毛發結構起到重要的作用。角蛋白家族又由角蛋白關聯蛋白(KAP)和角蛋白中間絲蛋白(KIF)組成。其中 KIF基因的編碼序列和結構基礎在進化過程中相對保守，物種間差異并不顯著。而KRTAP基因則在不同物種和相同物種不同種系間都存在顯著差異，是決定毛發結構和性狀的主效基因家族。目前，依據氨基酸一致性和相關含量將KRTAP家族劃分為三大類：高硫KRTAP家族、超高硫KRTAP家族和高甘氨酸/酪氨酸KRTAP家族。其中高硫KRTAP 家族中的KRTAP13-1基因，在山羊、綿羊與人類的序列分析中存在高度同源性。并且在前期研究中發現，在人類毛囊中，KAP11-1和KAP13-1 是分布范圍最廣泛的兩種KAP。同樣對綿羊毛囊蛋白質組學研究表明， KAP11-1和KAP13-1是在毛囊形態發生過程中最早表達的兩種KAP。這兩種KAP可能參與了毛囊的構成并進而影響了毛發性狀。雖然， KRTAP13-1基因已經被證實與絨毛纖維直徑性狀存在密切聯系。在中國的一些綿羊和山羊品系中：新吉細毛羊、西藏絨山羊、博格達絨山羊、內蒙古絨山羊和遼寧絨山羊中均發現KRTAP13-1基因的多態性變化對于羊絨纖維性狀存在著較大的影響。但是現在并未有研究揭示 KRTAP13-1基因對于毛囊結構和發育的具體作用機制，故而探究 KRTAP13-1基因對毛囊的研究工作有著重要意義。

利用CRISPER-Cas9系統敲除山羊KRTAP13-1基因的研究未見報道

發明內容

發明的目的是提供CRISPR/Cas9系統介導山羊KRTAP13-1基因定點敲除的方法。