[發明專利]應用枯草芽孢桿菌群體響應調控系統合成MK-7的方法

有效

• 申請號: 201910490611.1
• 申請日: 2019-06-06
• 公開（公告）號: CN110157749B
• 公開（公告）日: 2020-10-09
• 發明（設計）人: 劉龍;崔世修;呂雪芹;李江華;堵國成;陳堅
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12R1/125
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠知識產權代理有限公司 23211
• 代理人: 林娟

1.一種應用枯草芽孢桿菌群體響應調控系統合成MK-7的方法，其特征在于，在枯草芽孢桿菌的染色體上進行了如下改造：

(1)將組氨酸激酶KinA的基因進行截短突變并且進行了組成型表達，同時敲除組氨酸激酶KinB的基因；所述截短突變是指敲除組氨酸激酶KinA基因的信號傳導部分的PAS-A區域，敲除后的組氨酸激酶KinA基因kinA-ΔPAS-A的序列如SEQ ID NO.9所示；

(2)將含有P_hag啟動子的Rap60基因整合到染色體上，并在染色體上Rap60基因下游整合兩個拷貝的信號分子Phr60的表達框；

(3)使用P_abrB(cs-1)啟動子替換丙酮酸激酶基因和十一碳烯基焦磷酸合成酶基因的啟動子；所述P_abrB(cs-1)啟動子的序列如SEQ ID NO.14所示。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(1)中所述組氨酸激酶KinA的genebank ID為939230；所述組氨酸激酶KinB的genebank ID為937167。

3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(2)中所述P_hag啟動子序列如SEQ IDNO.16所示；所述轉錄因子Rap60的genebank ID為1115983；所述信號分子Phr60的表達框的序列如SEQ ID NO.17所示。

4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(3)中所述丙酮酸激酶基因pyk的genebank ID為936596；所述十一碳烯基焦磷酸合成酶基因uppS的genebank ID為939640。

5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法還包括使用P_{spoiia(cs-1,3)}啟動子表達七聚二烯丙基二磷酸合成酶基因和4-羥基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸還原酶基因；所述P_{spoiia(cs-1,3)}啟動子的序列如SEQ ID NO.12所示。

6.一種生產七烯甲萘醌的重組菌，其特征在于，在枯草芽孢桿菌的染色體上進行了如下改造：

(1)將組氨酸激酶KinA的基因進行截短突變并且進行了組成型表達，同時敲除組氨酸激酶KinB的基因；所述截短突變是指敲除組氨酸激酶KinA基因的信號傳導部分的PAS-A區域，敲除后的組氨酸激酶KinA基因kinA-ΔPAS-A的序列如SEQ ID NO.9所示；

(2)將含有P_hag啟動子的Rap60基因整合到染色體上，并在染色體上Rap60基因下游整合兩個拷貝的信號分子Phr60的表達框；

(3)使用P_abrB(cs-1)啟動子替換丙酮酸激酶基因和十一碳烯基焦磷酸合成酶基因的啟動子；所述P_abrB(cs-1)啟動子的序列如SEQ ID NO.14所示。

7.根據權利要求6所述的重組菌，其特征在于，步驟(1)中所述組氨酸激酶KinA的genebank ID為939230；所述組氨酸激酶KinB的genebank ID為937167。

8.根據權利要求6所述的重組菌，其特征在于，步驟(2)中所述P_hag啟動子序列如SEQ IDNO.16所示；所述轉錄因子Rap60的genebank ID為1115983；所述信號分子Phr60的表達框的序列如SEQ ID NO.17所示。

9.根據權利要求6所述的重組菌，其特征在于，步驟(3)中所述丙酮酸激酶基因pyk的genebank ID為936596；所述十一碳烯基焦磷酸合成酶基因uppS的genebank ID為939640。

10.根據權利要求6所述的重組菌，其特征在于，所述重組菌在權利要求6的基礎上做了如下改造：使用P_{spoiia(cs-1,3)}啟動子表達七聚二烯丙基二磷酸合成酶基因和4-羥基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸還原酶基因；所述P_{spoiia(cs-1,3)}啟動子的序列如SEQ ID NO.12所示。