[發(fā)明專利]高通量誘變篩選高產(chǎn)兩性霉素B結(jié)節(jié)鏈霉菌的方法及菌株

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201910450165.1
• 申請日: 2019-05-28
• 公開（公告）號: CN110564718B
• 公開（公告）日: 2021-05-04
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 柳志強(qiáng);鄭裕國;黃愷;張博;姜圣賢;張雨函;陳燏
• 申請（專利權(quán)）人: 浙江工業(yè)大學(xué)
• 主分類號: C12N13/00
• 分類號: C12N13/00;C12N15/01;C12N1/21;C12P19/62;C12R1/465
• 代理公司: 浙江千克知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 33246
• 代理人: 冷紅梅

本發(fā)明涉及本發(fā)明涉及一種高通量誘變篩選高產(chǎn)兩性霉素B結(jié)節(jié)鏈霉菌的方法，以及篩選到的誘變株，由誘變株獲得的重組工程菌及應(yīng)用。本發(fā)明篩選獲得的一株高產(chǎn)兩性霉素B結(jié)節(jié)鏈霉菌菌株——結(jié)節(jié)鏈霉菌(Streptomyces nodosus)ZJB2016050。本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在：1、通過高通量篩選高產(chǎn)兩性霉素B菌種的方法，能夠方便快速高效地檢測兩性霉素B的產(chǎn)量，提高了誘變育種和基因工程菌株的篩選或驗(yàn)證效率。2、誘變育種獲得的結(jié)節(jié)鏈霉菌N5，相對原始菌株N3，兩性霉素B產(chǎn)量提高了20％，能夠作為基因工程菌的原始菌株。3、通過過表達(dá)功能基因分別提高兩性霉素B的產(chǎn)量，其中乙酰輔酶A羧化酶1(acc1)提高兩性霉素B產(chǎn)量20％。4、卡那霉素價(jià)格優(yōu)廉、抗菌譜廣、殺菌作用強(qiáng)，適用于工業(yè)中使用，對于企業(yè)總體收益率有較強(qiáng)提高作用，以實(shí)驗(yàn)室5L罐為計(jì)算，能降低成本約2000元/罐。

(一)技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種高通量誘變篩選高產(chǎn)兩性霉素B結(jié)節(jié)鏈霉菌的方法，以及篩選到的誘變株，由誘變株獲得的重組工程菌及應(yīng)用。

(二)背景技術(shù)

多烯大環(huán)內(nèi)酯類抗生素是一類主要由鏈霉菌次級代謝產(chǎn)物組成的抗生素。該類抗生素具有廣譜的抗真菌活性及很小的耐受性，成為目前為止最有效的抗真菌藥物，廣泛應(yīng)用于治療各類由真菌引起的感染性疾病。兩性霉素B(Amphotericin B，AmB)首次發(fā)現(xiàn)于1955年，從委內(nèi)瑞拉奧里諾科河水土樣中的結(jié)節(jié)鏈霉菌(Streptomyces nodosus)中人們首次分離得到了兩性霉素B。兩性霉素B于1959年在結(jié)節(jié)鏈霉菌發(fā)酵液中提取獲得，于1966年開始上市。兩性霉素B是首個(gè)在臨床上被應(yīng)用于深部真菌感染的藥物，至今仍然是不可代替的抗真菌藥物。AmB具有廣譜性的對真菌抗性，特別是對于具有生命威脅性的全身性真菌感染例如白色念珠菌，曲霉屬真菌等，同時(shí)還具有有效的抗病毒、寄生蟲藥性，例如阮病毒、利什曼原蟲等。AmB多用于免疫系統(tǒng)損傷或免疫力較差患者，如器官移植接受者，HIV患者，以及使用抑制免疫力藥物的腫瘤患者等。

研究表明兩性霉素B最初在真菌細(xì)胞膜上聚集并插入細(xì)胞膜形成一個(gè)V型的孔道，兩性霉素B分子傾斜使得多烯內(nèi)酯環(huán)上的末端OH基團(tuán)朝向脂雙層中心，但這個(gè)過程并沒有固醇參與，且V型孔道不貫穿細(xì)胞膜，如圖1。在這種構(gòu)象中，V型孔道可以加載離子或小分子非電解質(zhì)(如尿素)，但是直到短暫的“開放”狀態(tài)(兩性霉素B分子垂直于膜平面,允許溶質(zhì)的擴(kuò)散)才會(huì)發(fā)生離子穿膜。在兩性霉素B濃度高于閾值時(shí)，脂雙層的厚度進(jìn)一步降低，固醇分子和兩性霉素B分子共同形成跨膜孔道。值得注意的是固醇分子直接參與形成跨膜孔道，而不是協(xié)助V型孔道穿膜。細(xì)胞內(nèi)的離子和小分子物質(zhì)通過這些跨膜孔道大量流失造成細(xì)胞死亡。

隨著環(huán)境和生活水平的變化及耐藥性的增強(qiáng)，真菌感染問題日益嚴(yán)峻，而近年來兩性霉素B局部用藥的提出和各類兩性霉素B衍生藥物的上市，降低了兩性霉素B對人體的毒副作用，擴(kuò)大了兩性霉素B的應(yīng)用范圍。廣闊的市場前景使研究兩性霉素B提產(chǎn)仍有巨大的意義和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。兩性霉素B的化學(xué)結(jié)構(gòu)復(fù)雜，目前多采用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)，因此篩選優(yōu)秀的兩性霉素B高產(chǎn)菌株是比較重要的前體。目前對于獲得高產(chǎn)菌株的方法一般為兩大類：傳統(tǒng)誘變育種和基因工程改造菌種。傳統(tǒng)育種分為物理誘變、化學(xué)誘變、混合誘變及其他方法；基因工程改造菌種一般通過改變菌種內(nèi)前體代謝的路徑，能量代謝，切斷競爭支路等方法來提高產(chǎn)量。同時(shí)兩大類方法都需要一種高效便捷快速的高通量篩選方法來初步篩選，以提高育種或構(gòu)建菌種的效率。

抑菌圈法又叫擴(kuò)散法，是利用待測藥物在瓊脂平板中擴(kuò)散使其周圍的細(xì)菌生長受到抑制而形成透明圈，即抑菌圈，根據(jù)抑菌圈大小判定待測藥物抑菌效價(jià)的一種方法。抑菌圈法操作便捷、簡單易行、成本低廉、結(jié)果準(zhǔn)確可靠，被廣泛用于抗生素等代謝產(chǎn)物菌種篩選的初篩。工具菌一般采用抗生素的敏感菌。若被檢菌能分泌某些抑制工具菌生長的物質(zhì)，如抗生素等，便會(huì)在該菌落周圍形成工具菌不能生長的抑菌圈，很容易被鑒別出來。

(三)發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明目的本發(fā)明目的是一種高通量誘變篩選高產(chǎn)兩性霉素B結(jié)節(jié)鏈霉菌的方法，以及篩選到的高產(chǎn)兩性霉素B誘變株，由誘變株獲得的重組工程菌及應(yīng)用。

本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：