[發明專利]一種嗜熱淀粉分支酶誘導發酵的生產方法

有效

• 申請號: 201910447580.1
• 申請日: 2019-05-27
• 公開（公告）號: CN110184248B
• 公開（公告）日: 2023-04-25
• 發明（設計）人: 胡先望;張鳴明;李素岳;何海寧;洪霞;郭立群;梁寧;廣忠勇;張春園
• 申請（專利權）人: 甘肅省商業科技研究所有限公司
• 主分類號: C12N9/10
• 分類號: C12N9/10;C12N1/20;C12R1/07
• 代理公司: 蘭州中科華西專利代理有限公司 62002
• 代理人: 李艷華

1.一種嗜熱淀粉分支酶誘導發酵的生產方法，包括以下步驟：

⑴菌種活化：

將購買的嗜熱脂肪芽胞桿菌Ⅰ、嗜熱脂肪芽胞桿菌Ⅱ、嗜熱脂肪芽胞桿菌Ⅲ冷凍干燥菌粉按20mg~50?mg/8~10mL分別接種于牛肉浸膏液體培養基中，三種菌分別于45?℃、50?℃、55?℃恒溫搖床中，以150?r/min的轉速培養72?h，分別得到活化的嗜熱脂肪芽胞桿菌Ⅰ、活化的嗜熱脂肪芽胞桿菌Ⅱ、活化的嗜熱脂肪芽胞桿菌Ⅲ；所述嗜熱脂肪芽胞桿菌Ⅰ的微生物編號為CGMCC1.1865；嗜熱脂肪芽胞桿菌Ⅱ的微生物編號為CGMCC1.1923；嗜熱脂肪芽胞桿菌Ⅲ的生物編號為ACTT7953；

⑵菌種保藏：

將所述活化的嗜熱脂肪芽胞桿菌Ⅰ、活化的嗜熱脂肪芽胞桿菌Ⅱ、活化的嗜熱脂肪芽胞桿菌Ⅲ使用接種環按0.1~0.2mL/8~10mL分別接種于牛肉浸膏瓊脂糖培養基中，分別于45℃、50?℃、55?℃恒溫培養72?h，當菌落均勻長滿斜面后，于冰箱0℃~4℃過夜后，再于-18℃冷凍保藏，分別得到三種嗜熱脂肪芽胞桿菌保藏的斜面菌種；

⑶菌種試管培養：

將所述三種嗜熱脂肪芽胞桿菌保藏的斜面菌種使用接種環按2~3環/8~10mL分別接種于種子試管培養基中，分別于45?℃、50?℃、55?℃恒溫培養72?h，分別得到三種試管種子菌種，于0?℃~4℃保藏備用；其中：嗜熱脂肪芽胞桿菌Ⅰ選育分離后的菌種編號為BTS-Ⅰ、嗜熱脂肪芽胞桿菌Ⅱ選育分離后的菌種編號為BTS-Ⅱ、嗜熱脂肪芽胞桿菌Ⅲ選育分離后的菌種編號為BTS-Ⅲ；

⑷三角瓶種子培養：

將所述BTS-Ⅰ試管種子菌種、BTS-Ⅱ試管種子菌種、BTS-Ⅲ試管種子菌種按5%~10%的接種比例分別接種于搖瓶發酵培養基中，在搖床為轉速150?r/min的條件下分別于45℃、50℃、55℃恒溫培養72?h，分別得到BTS-Ⅰ搖瓶種子菌種、BTS-Ⅱ搖瓶種子菌種、BTS-Ⅲ搖瓶種子菌種，于0?℃~4℃保藏備用；

⑸淀粉分支酶的液體發酵：

在5L發酵罐中裝入4L發酵培養基，121℃滅菌20min，冷卻至45℃；然后將所述BTS-Ⅰ搖瓶種子菌種或所述BTS-Ⅱ搖瓶種子菌種或所述BTS-Ⅲ搖瓶種子菌種按5%~10%的接種比例接種于裝有4L發酵培養基容量為5L的發酵罐中發酵培養，得到發酵種子菌種；

在100L發酵罐中裝入60L發酵培養基，121℃滅菌20min，冷卻至45℃；將所述發酵種子菌種按5%~10%的接種比例接種其中進行擴大培養，即得淀粉分支酶發酵液；

⑹淀粉分支酶分離制備：

所述淀粉分支酶發酵液經膜濃縮后離心，得濃縮分支酶；所述膜濃縮是指將淀粉分支酶發酵液經10μm膜、3~4Bar板框壓濾，得上清液A，然后再經0.45μm膜、3~4Bar板框壓濾，得上清液B；所述上清液B使用E2012C-28D、截留分子量≤1000的超濾膜濃縮至原液體積的5~8%；

⑺淀粉分支酶凍干：

所述濃縮分支酶經冷凍干燥、粉粹、過60目篩，即得凍干分支酶產品；

⑻淀粉分支酶純化：

所述濃縮分支酶樣品經硫酸銨鹽析、柱層析分離，即得純化的淀粉分支酶；所述硫酸銨鹽析是指濃縮分支酶樣品放入玻璃燒杯中，加入硫酸銨至飽和度80，用1mol/L?NaOH溶液調整pH=4.5后，于0~4℃沉淀12h，15000?g×離心15min，得到沉淀物；沉淀物用250mL，pH=6.5的0.02mol/L磷酸緩沖液溶解后，裝入截留分子量4000da的透析袋中，使用0.02mol/L的PBS溶液為透析液，0~4℃透析，每次使用透析液5L，4~6h更換透析液，直至使用0.1mol/L的AgNO₃溶液檢測無SO₄^2-離子，共更換透析液5次，透析30h，即得透析分支酶。

2.如權利要求1所述的一種嗜熱淀粉分支酶誘導發酵的生產方法，其特征在于：所述步驟⑴中牛肉浸膏液體培養基是指將1kg剔除肉筋和脂肪后的新鮮牛肉絞成肉泥，加入2.5L去離子水，0~4℃冷浸12h，煮沸2h，冷卻后3層紗布過濾，0.1mol/LNaOH溶液調pH值至7.0~7.5，10μm膜壓濾去除沉淀，上清補水至2.5L；然后分裝至25mL的試管或250mL三角瓶中，其中試管每管8~10mL，三角瓶每瓶150mL；封裝后無菌膜封口，121℃滅菌20min后冷卻即得。