[發(fā)明專利]一種LRFFT1細胞的構(gòu)建方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201910439145.4
• 申請日: 2019-05-24
• 公開（公告）號: CN110093376B
• 公開（公告）日: 2021-01-22
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 焦順昌;張嶸;張?zhí)熨x;周子珊;宋玉潔;陳小彬;吳子明
• 申請（專利權(quán)）人: 北京鼎成肽源生物技術(shù)有限公司
• 主分類號: C12N15/90
• 分類號: C12N15/90;C12N5/10
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種LRFFT1細胞的構(gòu)建方法，其特征在于，所述構(gòu)建方法的步驟如下：

1）通過測序腫瘤細胞篩選出突變位點，以突變的氨基酸位點為中心，向兩側(cè)各延伸8個氨基酸，將這段17個氨基酸的多肽作為潛在抗原表位，使用預(yù)測軟件分析潛在抗原表位的IC50，IC50＜1000nM則認為此潛在抗原表位為抗原表位；

2）使用上步軟件分析任意抗原表位兩兩相連后接頭處的IC50，IC50≥1000nM時認為是弱免疫原性，使用弱免疫原性的接頭將抗原表位連接在一起，合成連接后的突變多肽的基因序列；

3）構(gòu)建表達突變多肽的慢病毒載體，包裝慢病毒；

4）使用所述慢病毒轉(zhuǎn)染抗原遞呈細胞并與PBMC共培養(yǎng)，獲得LFF細胞；

5）所述突變多肽作為抗原刺激所述LFF細胞，通過檢測IFN-γ的分泌，篩選出有效的精準(zhǔn)多肽；所述精準(zhǔn)多肽評判標(biāo)準(zhǔn)：設(shè)置陽性對照：T細胞+100 ng/mL OKT3；陰性對照：T細胞+1640+10%FBS+200 U/mL IL2；陽性對照和陰性對照正常，則說明此數(shù)據(jù)可信；實驗組IFN-γ的釋放量顯著大于陰性對照組的為有效的精準(zhǔn)多肽；

6）以所述精準(zhǔn)多肽作為抗原刺激所述LFF細胞，對刺激后的細胞進行CD8、CD137、IFN-γ的染色，并以流式細胞儀進行分選，篩選出能夠識別所述精準(zhǔn)多肽的特異性細胞，測序并得到特異性細胞的高頻TCR基因；

7）利用CRISPR技術(shù)敲除外周血T細胞中原有的TCR基因，轉(zhuǎn)入上步所述高頻TCR基因，獲得TCR-T細胞；

8）利用CRISPR技術(shù)敲除細胞表面免疫抑制性信號分子，即得LRFFT1細胞。

2.如權(quán)利要求1所述的LRFFT1細胞的構(gòu)建方法，其特征在于，所述步驟1中測序是使用腫瘤患者人源外周血或市售工程細胞系進行ctDNA測序，或者使用患者腫瘤組織進行全外顯子測序。

3.如權(quán)利要求2所述的LRFFT1細胞的構(gòu)建方法，其特征在于，所述市售工程細胞系包括：H1299、H226、H358、H1563、H2228、A549、Renca、LLC 小鼠Lewis肺癌細胞、CRL-6323B16F1、CRL-2539 4T1、U14 小鼠子宮頸癌細胞、BV-2小鼠小膠質(zhì)瘤細胞、G422 小鼠神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞。

4.如權(quán)利要求1所述的LRFFT1細胞的構(gòu)建方法，其特征在于，所述步驟2中連接抗原表位的接頭處IC50要高于兩側(cè)抗原表位的IC50。

5.如權(quán)利要求1所述的LRFFT1細胞的構(gòu)建方法，其特征在于，所述步驟4中抗原遞呈細胞與PBMC以1：5-20的比例混合共培養(yǎng)。

6.如權(quán)利要求1所述的LRFFT1細胞的構(gòu)建方法，其特征在于，所述步驟6中以流式細胞儀進行分選，選擇CD8+CD137+或者CD8+IFN-γ+細胞。

7.如權(quán)利要求1所述的LRFFT1細胞的構(gòu)建方法，其特征在于，所述細胞表面抑制性信號分子包括：PD-1、Tim-3、LAG3、CTLA-4、BTLA、VISTA、CD160、2B4（CD244）。

8.如權(quán)利要求1所述的LRFFT1細胞的構(gòu)建方法，其特征在于，所述抗原遞呈細胞包括：外周血單個核細胞、樹突狀細胞、中性粒細胞、B淋巴細胞、巨噬細胞。