[發明專利]一種制備沙海蜇毒素抗毒血清的方法

有效

• 申請號: 201910432846.5
• 申請日: 2019-05-23
• 公開（公告）號: CN110128534B
• 公開（公告）日: 2023-01-24
• 發明（設計）人: 李榮鋒;李鵬程;于華華;李翱宇;于春林
• 申請（專利權）人: 中國科學院海洋研究所
• 主分類號: C07K16/18
• 分類號: C07K16/18;C07K16/06;C07K1/22
• 代理公司: 沈陽科苑專利商標代理有限公司 21002
• 代理人: 李穎

1.一種沙海蜇毒素抗毒血清的制備方法，其特征在于：

沙海蜇毒素采用甲醛進行減毒，減毒處理后沙海蜇毒素的與弗氏佐劑混合進行動物免疫，期間不斷進行效價檢測，免疫后采血，離心制備兔血清；然后使用沙海蜇毒素特異偶聯的CNBr-activated Agarose 4B親和層析填料進行親和層析對血清進行純化，最終獲得純凈沙海蜇毒素特異性抗體；

所述減毒處理為向沙海蜇毒素中加入濃度為35-40%甲醛并于37℃恒溫箱中恒溫反應5-7天；而后再次加入濃度為35-40%甲醛， 再于37℃恒溫反應5-7天；隨后透析除去甲醛，高速離心、過濾后將上清液保存于-80℃待用；所述的透析液為pH7.0，濃度為20-50 mM PBS；35-40%甲醛與毒素的體積比值為0.4%-6%；

所述離心獲得抗毒血清使用沙海蜇毒素蛋白特異偶聯的CNBr-activated Agarose 4B親和層析填料進行層析純化，進而得到沙海蜇毒素蛋白特異性免疫球蛋白抗體；

所述親和純化填料制備，先使用1-3mM HCl活化CNBr-activated Agarose 4B填料，再將其與沙海蜇毒素在20-50 mM Na₂CO₃堿性條件下，于4°C偶聯 8-12h，即得到沙海蜇毒素偶聯的CNBr-activated Agarose 4B親和層析填料；

所述動物免疫：使用新西蘭大白兔作為免疫動物，采用減毒后的沙海蜇毒素抗原與弗氏完全佐劑混合進行初免，初免后進行三次加強免疫，分別于初次免疫后 2 周、4 周、6 周使用沙海蜇毒素抗原與弗氏不完全佐劑免疫三次；所述減毒后的沙海蜇毒素抗原與弗氏完全佐劑或弗氏不完全佐劑體積比為1:0.8-1.2；

所述初免的免疫劑量為0.3-0.4mg/kg；初次免疫3周后進行第二次免疫，免疫劑量為0.15-0.2mg/kg；2周后進行第三次免疫，免疫劑量為0.15-0.2g/kg ，2周后進行第四次免疫，免疫劑量為0.15-0.2mg/kg；免疫結束后測定其效價。

2.按權利要求1所述的沙海蜇毒素抗毒血清的制備方法，其特征在于：所述層析純化使用pH7.0, 20-50mM Na2PO4沖洗層析填料，加入上述獲得抗毒血清，于4°C搖床過夜，棄上清液，最后使用pH=2.0-3.0,20-50mM甘氨酸洗脫填料，從而得到沙海蜇毒素蛋白特異性免疫球蛋白抗體。