[發明專利]一種提取黃瓜線粒體及其DNA的有效方法

有效

• 申請號: 201910431970.X
• 申請日: 2019-05-22
• 公開（公告）號: CN110438118B
• 公開（公告）日: 2022-07-05
• 發明（設計）人: 陳勁楓;孟雅;翟于菲;虞夏清
• 申請（專利權）人: 南京農業大學
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發明公開了一種提取黃瓜線粒體及其DNA的方法，屬于植物生物技術領域。以黃瓜黃化苗為材料，調整提取過程組織勻漿緩沖液成分和差速離心力組合，結合percoll密度梯度離心分離得到線粒體，并使用3％CTAB裂解線粒體，后續用氯仿?異戊醇抽提得到高質量mtDNA。最終所提取線粒體完整性好，純化后mtDNA濃度為158ng·μL^?1，每20g葉片可得7.9μg mtDNA。其中A260/A280約1.87，說明本方法提取分離得到的mtDNA純度高。本發明首次建立一套適用于黃瓜mtDNA提取純化的有效體系，對于其他物種構建mtDNA提取純化體系具有參考意義。

一、技術領域

本發明涉及一種提取黃瓜線粒體及其DNA的有效方法，適用于黃瓜線粒體DNA分離純化，屬于植物生物技術領域。

二、背景技術

線粒體作為一種半自主性細胞器，是細胞能量代謝重要場所(Lane et al.，2010)，在植物生長發育和繁殖等過程中發揮重要作用(Cui et al.，2012)。線粒體基因組擁有自身獨立的轉錄和翻譯系統，同時受到細胞核基因的調控(張曉等，2011；蘇愛國等，2011)。

黃瓜(Cucumis sativus L.)是我國重要的蔬菜作物，其線粒體基因組高達1685kb(Andrew J et al.，2011)，數倍于其他植物的線粒體基因組。作為一個細胞內遺傳物質表現出三種不同遺傳方式的雙子葉植物，黃瓜線粒體呈現獨特的父系遺傳(HAVEY M J etal.，1998；SHEN J et al.， 2013)，是線粒體遺傳研究的絕佳體系。陳勁楓等人率先通過遠緣雜交成功獲得了野生酸黃瓜 (C.hystrix，2n＝2x＝24)和栽培黃瓜(C.sativus，2n＝2x＝14)的種間雜交黃瓜(Chen et al.，2000)，為研究甜瓜屬種間雜交質體的遺傳研究提供了良好材料。因此提取高質量黃瓜mtDNA是進行線粒體基因組功能分析，成為進一步開展黃瓜種間雜交核質互作、細胞器遺傳進化等研究工作的關鍵。

然而，由于植物細胞中細胞壁、液泡和葉綠體的影響，使黃瓜線粒體的分離變得更加困難。另外，黃瓜基因組較大的原因主要是包含了大量的重復序列以及外源序列片段，包括核基因組序列、葉綠體基因組序列以及病毒細菌的序列，而并非包含更多的基因。因此，和其他作物相比，黃瓜mtDNA的提取難度更大，目前還沒有關于黃瓜mtDNA提取方法的報道。

三、發明內容

技術問題

本發明的目的是提供一種提取黃瓜線粒體及其DNA的有效方法，適用于黃瓜線粒體 DNA分離純化。要想得到高純度的mtDNA，需要除去核基因和葉綠體基因等污染。經過差速離心法可以去除核基因污染，但是無法將沉降系數差異小的葉綠體和線粒體分開。本發明結合不同植物mtDNA提取方法，調整組織勻漿緩沖液成分和差速離心力組合，結合percoll 密度梯度離心分離得到線粒體，成功構建了黃瓜mtDNA提取純化體系，并且成本低、操作簡單，產物質量高，這為進一步研究黃瓜線粒體基因組的核質互作、遺傳差異等科學問題奠定基礎。

技術方案

本發明基于前期不斷摸索提取過程的組織勻漿緩沖液成分和差速離心力組合，結合 percoll密度梯度離心分離得到線粒體，現得到適用于黃瓜mtDNA提取純化有效體系。具體實驗內容如下：

1.葉片組織破碎：

(1)摘取適量預冷的黃化苗葉片，放入1∶6稀釋最終濃度1％的消毒液中清洗2分鐘，之后置于冰水中清洗3遍；

(2)稱取上述組織20g置于組織破碎機(JJ-2，溫州標諾儀器有限公司)，加入200mL組織勻漿緩沖液，同時加入0.28g半胱氨酸，在較低設置下勻漿3次，每次約5秒；

(3)勻漿液用8層提前預冷無菌紗布和200目細胞篩依次過濾，并在冰上收集濾液，等量分裝于4個無菌的50mL離心管中；

2.線粒體的提取與分離：