[發明專利]攜帶NanoLuc基因的重組禽流感病毒及其在活體成像小鼠模型中的應用

有效

• 申請號: 201910429596.X
• 申請日: 2019-05-22
• 公開（公告）號: CN110184284B
• 公開（公告）日: 2021-02-19
• 發明（設計）人: 亓文寶;勞光杰;廖明;馬凱雄;邱子雯
• 申請（專利權）人: 華南農業大學
• 主分類號: C12N15/53
• 分類號: C12N15/53;C12N15/66;C12N15/63;C12N7/01;C12N15/86;A01K67/027
• 代理公司: 廣州市華學知識產權代理有限公司 44245
• 代理人: 劉瑜

本發明公開了一種攜帶NanoLuc基因的重組禽流感病毒及其在活體成像小鼠模型中的應用。本發明提供了一種DNA片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，可將其用于構建重組質粒、重組病毒和小鼠模型。本發明中構建一種重組禽流感病毒，其與野生型病毒的復制能力和致病力相近。在SPF雞胚傳代中，收集的4代病毒液都能檢測到NanoLuc熒光素酶基因，具有良好的穩定性。本發明中還成功構建了活體成像小鼠模型，具有可視化功能，在不需要剖解小鼠情況下，能夠檢測流感病毒在小鼠的分布位置。能夠實現縱向評估，在同一小鼠上連續時間觀察流感病毒的感染動態過程，為流感病毒的研究補充了一種可視化工具。

技術領域

本發明屬于分子生物學和基因工程領域，特別涉及一種攜帶NanoLuc基因的重組禽流感病毒及其在活體成像小鼠模型中的應用。

背景技術

H9N2亞型禽流感病毒是甲型流感病毒的一種，廣泛流行于世界各個地區，不僅給家禽業帶來巨大的危害，還可以跨過宿主屏障感染人，在公共衛生上具有重要意義^[1]。

小鼠模型是一種研究流感病毒在體內感染、致病性以及傳播能力等常用的動物模型^[2,3]。但在小鼠模型中不能實時觀察到病毒在機體病毒的分布情況和感染的動態過程，另外，病毒載量的評估還需要剖殺小鼠，從而排除了縱向評估。生物發光報告病毒的體內成像是一種強有力的替代方法，能夠實時觀察病毒在同一動物體中的傳播以及對病毒載量的快速評估。

NanoLuc熒光素酶是由深海蝦Oplophorus gracilirostris的熒光素酶亞基改造而成的，大小僅為19kDa，信號半衰期大于2小時，具有分子量小、檢測靈敏度高等優點，它比螢火蟲或海腎熒光素酶的活性高150倍(即光輸出)^[4]。

目前，還沒有攜帶NanoLuc熒光素酶基因的重組H9N2亞型禽流感病毒及相關應用的研究。

發明內容

本發明的首要目的在于克服現有技術的缺點與不足，提供一種DNA片段。

本發明的另一目的在于提供所述DNA片段在構建重組質粒或重組病毒中的應用。

本發明的又一目的在于提供所述重組質粒在構建重組禽流感病毒中的應用。

本發明的再一目的在于提供所述重組禽流感病毒在構建小鼠模型中的應用。

本發明的目的通過下述技術方案實現：一種DNA片段，其核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。

含有所述的DNA片段的重組質粒或重組病毒。

一種重組質粒，為將所述的DNA片段(即V-NS-NanoLuc基因片段)插入到pHW2000質粒的BsmB I的酶切位點上獲得。

所述的重組質粒的構建方法，包括如下步驟：將所述的DNA片段用限制性內切酶Aar I進行酶切，然后將其用連接酶連接到用限制性內切酶BsmB I酶切后的pHW2000質粒上，得到重組質粒pHW2000-V-NS-NanoLuc。

所述的重組質粒在構建重組禽流感病毒中的應用。

所述的重組禽流感病毒的骨架優選為H9N2亞型禽流感病毒A/chicken/Guangdong/V/2008株。

一種攜帶NanoLuc熒光素酶基因的重組禽流感病毒的構建方法，包括如下步驟：

(1)構建7個基因的重組表達質粒：