[發(fā)明專利]系統(tǒng)性硬化癥診斷的脂肪酸代謝物分析檢測方法

在審

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• 申請日: 2019-05-22
• 公開（公告）號: CN110221011A
• 公開（公告）日: 2019-09-10
• 發(fā)明（設計）人: 王丹丹;孫凌云;馮學兵;張華勇;孫宸
• 申請（專利權）人: 南京鼓樓醫(yī)院
• 主分類號: G01N30/88
• 分類號: G01N30/88;G01N30/86
• 代理公司: 南京鐘山專利代理有限公司 32252
• 代理人: 蔣廈

1.一種系統(tǒng)性硬化癥診斷的脂肪酸代謝物分析檢測方法，其特征在于：樣品預處理后，采用超高效液相色譜UHPLC進行分離，色譜條件為：柱溫25℃；流速0.3mL/min；進樣量2μL；流動相組成A：水+25mM乙酸銨+25mM氨水，B：乙腈；梯度洗脫程序如下：0-1min，95％B；1-14min，B從95％線性變化至65％；14-16min，B從65％線性變化至40％；16-18min，B維持在40％；18-18.1min，B從40％線性變化至95％；18.1-23min，B維持在95％；自動進樣器4℃；為避免儀器檢測信號波動而造成的影響，采用隨機順序進行樣本的連續(xù)分析，樣本隊列中插入質控QC樣品，用于監(jiān)測和評價系統(tǒng)的穩(wěn)定性及實驗數(shù)據(jù)的可靠性；樣品經超高效液相色譜UHPLC分離后用質譜儀Q-TOF進行質譜分析，Q-TOF質譜條件為：分別采用電噴霧電離ESI正離子和負離子模式進行檢測。

2.根據(jù)權利要求1所述的系統(tǒng)性硬化癥診斷的脂肪酸代謝物分析檢測方法，其特征在于：樣品預處理步驟為：-80℃取樣本，在4℃環(huán)境下緩慢解凍后，分別取各組樣本100ul后加入400ul預冷甲醇/乙腈溶液渦旋混合，其中甲醇：乙腈＝1:1(v/v)，-20℃靜置60min，14000g4℃離心20min，取上清真空干燥。

3.根據(jù)權利要求1所述的系統(tǒng)性硬化癥診斷的脂肪酸代謝物分析檢測方法，其特征在于：所述的色譜柱為Agilent 1290 Infinity LC超高效液相色譜系統(tǒng)HILIC色譜柱；質譜儀為Triple TOF 5600質譜儀。

4.根據(jù)權利要求1所述的系統(tǒng)性硬化癥診斷的脂肪酸代謝物分析檢測方法，其特征在于：質譜分析時，樣品加入100μL乙腈水溶液復溶，其中乙腈：水＝1:1(v/v)，渦旋，14000g4℃離心15min，取上清液進樣分析。

5.根據(jù)權利要求1所述的系統(tǒng)性硬化癥診斷的脂肪酸代謝物分析檢測方法，其特征在于：每個待測樣本等量混合用于制備質控QC樣本，用于測定進樣前儀器狀態(tài)及平衡色譜-質譜系統(tǒng)，并用于評價整個實驗過程中系統(tǒng)穩(wěn)定性，剩余待測樣進行色譜-質譜檢測。

6.根據(jù)權利要求1所述的系統(tǒng)性硬化癥診斷的脂肪酸代謝物分析檢測方法，其特征在于：原始數(shù)據(jù)經ProteoWizard轉換成.mzXML格式，然后采用XCMS程序進行峰對齊、保留時間校正和提取峰面積，代謝物結構鑒定采用精確質量數(shù)匹配<25ppm和二級譜圖匹配的方式，檢索實驗室自建數(shù)據(jù)庫，對XCMS提取得到的數(shù)據(jù)，刪除組別總和>2/3的離子峰。

7.根據(jù)權利要求6所述的系統(tǒng)性硬化癥診斷的脂肪酸代謝物分析檢測方法，其特征在于：應用軟件SIMCA-P14.1，Umetrics，Umea，Sweden，進行模式識別，數(shù)據(jù)經Pareto-scaling預處理后，進行多維統(tǒng)計分析。

8.根據(jù)權利要求7所述的系統(tǒng)性硬化癥診斷的脂肪酸代謝物分析檢測方法，其特征在于：所述多維統(tǒng)計分析包括無監(jiān)督主成分分析PCA，有監(jiān)督偏最小二乘法判別分析PLS-DA和正交偏最小二乘法判別分析OPLS-DA，單維統(tǒng)計分析包括Student’s t-test和變異倍數(shù)分析，R軟件繪制火山圖；以VIP>1為篩選標準，初步篩選出各組間的差異物。

9.根據(jù)權利要求8所述的系統(tǒng)性硬化癥診斷的脂肪酸代謝物分析檢測方法，其特征在于：采用單變量統(tǒng)計分析，驗證差異代謝物是否具有顯著性，選擇同時具有多維統(tǒng)計分析VIP>1和單變量統(tǒng)計分析P value<0.05的代謝物，作為具有顯著性差異的代謝物；而VIP>1且0.05<P value<0.1則作為差異代謝物。