[發(fā)明專(zhuān)利]重組表達(dá)載體、靶向性的T細(xì)胞及它們的應(yīng)用

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201910407872.2
• 申請(qǐng)日: 2019-05-15
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN110257429A
• 公開(kāi)（公告）日: 2019-09-20
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 魏建樹(shù);韓為東;羅燦;伍志強(qiáng);王瑤;佟川;王曉慧
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院
• 主分類(lèi)號(hào): C12N15/867
• 分類(lèi)號(hào): C12N15/867;C12N15/62;C12N5/10;A61K39/00;A61P35/00
• 代理公司: 北京潤(rùn)平知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11283
• 代理人: 喬雪微;劉依云

1.一種重組表達(dá)載體，其特征在于，所述重組表達(dá)載體含有能夠表達(dá)RNAi的核苷酸序列1和能夠表達(dá)嵌合抗原受體的核苷酸序列2；

其中，所述RNAi能夠沉默PD-1；

其中，所述嵌合抗原受體為ScFv-CD8-CD137-CD3ζ，包括依次串聯(lián)的單鏈抗體ScFv、CD8的鉸鏈區(qū)和跨膜區(qū)、CD137的胞內(nèi)信號(hào)結(jié)構(gòu)域和CD3ζ的胞內(nèi)信號(hào)結(jié)構(gòu)域。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組表達(dá)載體，其中，所述RNAi為shRNA序列；

優(yōu)選的，所述shRNA序列為shRNA-3和/或shRNA-4；其中，

shRNA-3如SEQ ID NO.1所示，反義鏈如SEQ ID NO.2所示；

shRNA-4如SEQ ID NO.3所示，反義鏈如SEQ ID NO.4所示。

3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的重組表達(dá)載體，其中，所述重組表達(dá)載體中，在所述核苷酸序列1的上游，還含有U6啟動(dòng)子，以驅(qū)動(dòng)核苷酸序列1的表達(dá)。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組表達(dá)載體，其中，所述單鏈抗體ScFv選自CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD133、CD138、HER1和HER2中的至少一種；

優(yōu)選的，所述所述嵌合抗原受體為CD19ScFv-CD8-CD137-CD3ζ，具有SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列；

優(yōu)選的，所述核苷酸序列2具有如SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列。

5.根據(jù)權(quán)利要求1或4所述的重組表達(dá)載體，其中，所述重組表達(dá)載體中，在所述核苷酸序列2的上游，還含有延伸因子1-α，以驅(qū)動(dòng)所述核苷酸序列2的表達(dá)。

6.根據(jù)權(quán)利要求1、4或5所述的重組表達(dá)載體，其中，所述重組表達(dá)載體還含有通過(guò)T2A基序連接在核苷酸序列2下游的表達(dá)ZsGreen的核苷酸序列3。

7.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任意一項(xiàng)所述的重組表達(dá)載體，其中，所述重組表達(dá)載體為慢病毒表達(dá)載體；

優(yōu)選的，所述慢病毒表達(dá)載體為plvx-RNAi-ScFv-CD8-CD137-CD3ζ；其中，所述慢病毒表達(dá)載體中，在所述核苷酸序列1的上游，含有U6啟動(dòng)子，以驅(qū)動(dòng)核苷酸序列1的表達(dá)；在所述核苷酸序列2的上游，含有延伸因子1-α，以驅(qū)動(dòng)所述核苷酸序列2的表達(dá)；并且所述慢病毒表達(dá)載體還含有通過(guò)T2A基序連接在核苷酸序列2下游的表達(dá)ZsGreen的核苷酸序列3。

8.一種工程化的靶向性的T細(xì)胞，其特征在于，所述靶向性的T細(xì)胞含有權(quán)利要求1-7中任意一項(xiàng)所述的重組表達(dá)載體。

9.權(quán)利要求8所述的靶向性的T細(xì)胞的制備方法，其特征在于，所述方法包括：

包裝攜帶權(quán)利要求1-7中任意一項(xiàng)所述的重組表達(dá)載體的慢病毒，得到病毒原液；利用得到的病毒原液感染T細(xì)胞，使T細(xì)胞表達(dá)RNAi和表達(dá)所述嵌合抗原受體。

10.權(quán)利要求8所述的工程化靶向性的T細(xì)胞在制備用于治療B細(xì)胞系惡性血液系統(tǒng)腫瘤的藥物中的應(yīng)用；

優(yōu)選的，所述B細(xì)胞系惡性血液系統(tǒng)腫瘤包括非霍奇金淋巴瘤、B細(xì)胞慢性淋巴細(xì)胞白血病和B細(xì)胞急性淋巴細(xì)胞白血病中的至少一種。