[發(fā)明專利]用改變ppc啟動子的細(xì)菌發(fā)酵生產(chǎn)L-賴氨酸的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201910407560.1
• 申請日: 2019-05-16
• 公開（公告）號: CN110079566B
• 公開（公告）日: 2020-08-04
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 孟剛;周曉群;魏愛英;蘇厚波;馬風(fēng)勇;趙春光
• 申請（專利權(quán)）人: 黑龍江伊品生物科技有限公司
• 主分類號: C12P13/08
• 分類號: C12P13/08;C12N1/21;C12R1/15
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發(fā)明提供了發(fā)酵生產(chǎn)L?賴氨酸的方法，其包括改造谷氨酸棒桿菌染色體上野生型的ppc基因的啟動子區(qū)域；和，用改造而得到的谷氨酸棒桿菌發(fā)酵生產(chǎn)L?賴氨酸。另外，本發(fā)明還提供了由該方法衍生的方法和應(yīng)用，以及可以用在這些方法和應(yīng)用中的谷氨酸棒桿菌、多核苷酸等。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于氨基酸發(fā)酵領(lǐng)域，具體而言，本發(fā)明涉及發(fā)酵生產(chǎn)L-賴氨酸的方法及其衍生的方法和應(yīng)用，和可以用在這些方法和應(yīng)用中的細(xì)菌等。

背景技術(shù)

通過產(chǎn)L-賴氨酸的細(xì)菌（如，埃希氏菌屬的大腸桿菌和棒桿菌屬的桿狀細(xì)菌）發(fā)酵來生產(chǎn)L-賴氨酸已經(jīng)得到了產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用。這些細(xì)菌，可以是從自然界分離的細(xì)菌，也可以是通過誘變或基因工程改造獲得的細(xì)菌，或者兩者兼而有之。

現(xiàn)有文獻(xiàn)中有報道ppc（磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶，phosphoenolpyruvatecarboxylase）基因、其調(diào)控元件及其編碼蛋白的增加、減少或突變等用于氨基酸（包括L-賴氨酸）生產(chǎn)中，例如，WO0100844A2、WO2005058945A2、EP0358940A1和JP1998165180A等，然而，突變后的調(diào)控元件的性質(zhì)是難以預(yù)料的，相應(yīng)地，其對L-賴氨酸生產(chǎn)的影響也難以預(yù)料，尤其是，近十多年來，對ppc基因及其調(diào)控元件的突變對L-賴氨酸生產(chǎn)的影響的新的研究已經(jīng)越來越少，表明研究人員對是否有新的ppc基因及其調(diào)控元件的突變來改善L-賴氨酸生產(chǎn)的興趣已經(jīng)越來越小了。

本發(fā)明人沒有受到近十多年來的趨勢影響，經(jīng)過長期研究和實踐，尤其憑借了一些運氣，偶然發(fā)現(xiàn)對ppc基因調(diào)控元件的新的改造能夠有助于提高谷氨酸棒桿菌發(fā)酵生產(chǎn)L-賴氨酸的產(chǎn)量。而且，該方法與現(xiàn)有改造的大量高產(chǎn)L-賴氨酸的谷氨酸棒桿菌的染色體改造位點沒有沖突，可以疊加提高的效果，從而在實踐上可用于谷氨酸棒桿菌發(fā)酵生產(chǎn)L-賴氨酸。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題在于提供新的發(fā)酵生產(chǎn)L-賴氨酸的方法及其相關(guān)的方法，包括相對于未改造谷氨酸棒桿菌提高L-賴氨酸的發(fā)酵生產(chǎn)量的方法，改造的谷氨酸棒桿菌在發(fā)酵生產(chǎn)L-賴氨酸中的應(yīng)用，改造的谷氨酸棒桿菌在相對于未改造谷氨酸棒桿菌提高L-賴氨酸的發(fā)酵生產(chǎn)量的應(yīng)用，和/或，改造谷氨酸棒桿菌的方法等。另外，本發(fā)明還提供了可以用于上述方法中的突變蛋白、多核苷酸、載體和/或谷氨酸棒桿菌等。

具體而言，在第一方面，本發(fā)明提供了發(fā)酵生產(chǎn)L-賴氨酸的方法，其包括：

（1）改造谷氨酸棒桿菌染色體上野生型的ppc基因的啟動子區(qū)域，使該啟動子區(qū)域缺失一個或幾個核苷酸；和，

（2）用步驟（1）改造而得到的谷氨酸棒桿菌發(fā)酵生產(chǎn)L-賴氨酸。

在本文中，術(shù)語“改造”指的是是相應(yīng)被改造的對象發(fā)生變化，從而達(dá)到一定的效果。改造位于染色體上的基因或調(diào)控元件的手段包括但是不限于，誘變、定點突變、和/或同源重組，優(yōu)選是后兩者。改造位于染色體上的基因或調(diào)控元件使得該基因或調(diào)控元件的核苷酸序列被添加、缺失或替換一個或多個核苷酸。這些技術(shù)手段廣泛記載于分子生物學(xué)和微生物學(xué)文獻(xiàn)中，有許多甚至已經(jīng)商品化了。在本發(fā)明的具體實施方式中，根據(jù)同源重組的原理，可以采用Addgene公司商品化的pKOV質(zhì)粒系統(tǒng)來進(jìn)行改造，也可以采用pK18mobsacB質(zhì)粒系統(tǒng)來進(jìn)行改造，改造谷氨酸棒桿菌染色體上的野生型的ppc基因和/或其調(diào)控元件。因此，在本文中，優(yōu)選改造是通過同源重組進(jìn)行的改造。

本發(fā)明人經(jīng)過長期研究發(fā)現(xiàn)，在谷氨酸棒桿菌中，使野生型的ppc基因啟動子區(qū)域發(fā)生缺失，尤其是在對ppc基因改造的情況下，可以提高L-賴氨酸的。在本發(fā)明的具體實施方式中，改造谷氨酸棒桿菌染色體上野生型的ppc基因的啟動子區(qū)域，在ppc基因的第-1位缺失一個核苷酸。基因的-1位是基因編碼區(qū)第一個密碼子之前緊鄰的一個核苷酸，這是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。