[發明專利]神經壞死病毒MCP與鮰愛德華氏菌ompN1的融合蛋白及其制備方法

在審

• 申請號: 201910407330.5
• 申請日: 2019-05-16
• 公開（公告）號: CN111777683A
• 公開（公告）日: 2020-10-16
• 發明（設計）人: 王大勇;張轉丹;裴業春
• 申請（專利權）人: 王大勇
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;C12N15/62;C07K1/14
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現有商品化魚類神經壞死病毒疫苗須經注射接種。本發明涉及一種神經壞死病毒（Nervous necrosis virus）主要外殼蛋白（MCP）與鮰愛德華氏菌（Edwarsiella ictaluri）中具有跨膜作用的外膜蛋白1（ompN1）的基因重組融合蛋白MCP?ompN1，及其表達和制備方法。MCP與ompN1蛋白通過四個氨基酸“GGGS”構成的序列柔性連接。本發明首先針對BL21?DE3工程菌株的密碼子偏好性對編碼MCP?ompN1的核苷酸序列加以優化，然后構建表達質粒并在BL21?DE3菌株中表達，再經過菌體破碎，包涵體處理，蛋白質復性，鎳柱純化，用生物素標記的凝血酶切除組蛋白標簽，利用親和素樹脂除掉凝血酶等步驟分離純化出MCP?ompN1融合蛋白。基因重組MCP?ompN1融合蛋白可作為神經壞死病毒疫苗抗原、或神經壞死病毒與鮰愛德華氏菌疫苗抗原，其中的ompN1蛋白介導黏膜免疫作用。

技術領域

本發明屬于基因工程領域。具體涉及DNA及蛋白質一級結構、表達載體的構建和表達、以及蛋白質的分離和純化。

背景技術

病毒性神經壞死病是我國東南沿海地區，特別是在海南最常見、危害也最大的傳染病，常導致大批石斑魚魚苗和幼體發病死亡。該傳染病具有典型的神經癥狀，使魚類中樞神經和視網膜組織出現空泡壞死病變，并表現出游動異常。病魚除了神經異常外，無其它臨床病癥，體表及體內也無明顯的病理變化或寄生蟲寄生。該病可通過魚卵垂直傳播，也可經養殖水體水平傳播。來自受感染親本的垂直傳播是魚苗感染的主要途徑。各種石斑魚以及不同日齡的石斑魚均易感，但對幼體的危害更加嚴重。該病具有明顯的季節性，通常每年的4-8月份為發病高峰期。

神經壞死病毒(Nervous necrosis virus，NNV)屬于羅達病毒科，主要由衣殼和核心兩部分組成，無囊膜。衣殼由180個衣殼蛋白亞單位組成。病毒基因組大小約4.5kb，主要由RNA1和RNA2兩條單鏈正義RNA組成，兩條核酸鏈在5’端都有帽子結構，但沒有多聚腺苷酸尾。其中RNA2分子量約1.3-1.4kb，編碼病毒核衣殼蛋白的前體；RNA1分子量約3.0-3.2kb，主要編碼非結構的A蛋白，即RNA依賴性RNA聚合酶，參與復制RNA1和RNA2的復制。病毒的主要衣殼蛋白(Major capsid protein，MCP)包含該病毒的主要原決定簇，參與激活魚體內的抗原-抗體免疫反應。目前VNN病毒疫苗須經注射接種才能發揮有效的預防作用，目前尚無通過黏膜免疫，例如浸泡或投飼，實現有效預防接種的基因工程疫苗及抗原。

鮰愛德華氏菌(Edwarsiella ictaluri)屬于腸桿菌科愛德華氏菌屬的一種G-短桿菌。該菌是水生動物的常見高致死率的致病菌，其在魚類中主要引起斑點叉尾鮰腸型敗血癥。研究表明，它可以通過胃腸道、鰓、皮膚等粘膜組織或鼻孔進入魚體。該菌編碼的外膜蛋白N(ompN)參與細菌的粘附和侵襲，其中的ompN1蛋白參與了鞭毛在內膜和外膜之間的肽聚糖層的錨定，并且參與細胞的識別和蛋白信號的轉導，在鮰愛德華氏菌的跨粘膜致病機制中發揮重要作用。具體作用為：(1)參與粘附，在大多數感染中，病原菌只有吸附在宿主上才能致病；(2)幫助細菌跨越宿主的粘膜防御屏障；(3)幫助細菌逃避宿主免疫系統的免疫防御機制。因為ompN1蛋白所發揮的跨黏膜免疫作用，所以鮰愛德華氏菌疫苗可以通過浸泡的方法接種。

發明內容

1.發明的目的

本發明利用基因工程方法制備一種神經壞死病毒主要外殼蛋白MCP與鮰愛德華氏菌外膜蛋白ompN1的融合蛋白。MCP-ompN1融合蛋白可用作神經壞死病毒疫苗抗原、也可用做神經壞死病毒與鮰愛德華氏菌疫苗的抗原，其中的ompN1蛋白介導黏膜免疫作用。

2.發明的技術方案

一、從NCBI Genbank中分別獲得編碼神經壞死病毒MCP蛋白及鮰愛德華氏菌ompN1蛋白的基因序列。依據原核生物密碼子偏嗜性優化設計編碼MCP與ompN1融合蛋白的cDNA序列；編碼MCP和ompN1蛋白的cDNA通過編碼柔性連接氨基酸序列“GGGS”的cDNA相連。