[發(fā)明專利]角膜緣干細(xì)胞及其制備方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201910406925.9
• 申請(qǐng)日: 2019-05-16
• 公開（公告）號(hào): CN110079500B
• 公開（公告）日: 2021-04-27
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 武征;王穎薇;徐李玲;何程智;李國正
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 廣州市亮目生物科技有限公司
• 主分類號(hào): C12N5/0797
• 分類號(hào): C12N5/0797;C12N5/079
• 代理公司: 廣州華進(jìn)聯(lián)合專利商標(biāo)代理有限公司 44224
• 代理人: 向薇;萬志香

1.一種角膜緣干細(xì)胞的制備方法，其特征在于，包含以下步驟：

獲取角膜組織，將待用角膜組織預(yù)處理；

向預(yù)處理后的角膜組織中加入含有細(xì)胞誘導(dǎo)劑的細(xì)胞凍存液；

冷凍加有細(xì)胞凍存液的角膜組織；

所述的細(xì)胞誘導(dǎo)劑是可誘導(dǎo)角膜組織中的細(xì)胞局部發(fā)生炎癥或應(yīng)激反應(yīng)，但不直接引起細(xì)胞死亡的試劑；

所述細(xì)胞凍存液為含有所述細(xì)胞誘導(dǎo)劑的細(xì)胞培養(yǎng)液和冷凍保護(hù)劑的混合液；

所述細(xì)胞誘導(dǎo)劑為醋酸潑尼松龍和星狀孢菌素，所述醋酸潑尼松龍?jiān)谒黾?xì)胞培養(yǎng)液中的濃度為4μg/ml，所述星狀孢菌素在所述細(xì)胞培養(yǎng)液中的濃度為20ng/ml；或者，所述細(xì)胞誘導(dǎo)劑為醋酸潑尼松龍和腫瘤壞死因子α，所述醋酸潑尼松龍?jiān)谒黾?xì)胞培養(yǎng)液中的濃度為4μg/ml，所述腫瘤壞死因子α在所述細(xì)胞培養(yǎng)液中的濃度為10ng/ml；

所述冷凍采用液氮冰凍；

所述冷凍的時(shí)間為3個(gè)月或者6個(gè)月。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的角膜緣干細(xì)胞的制備方法，其特征在于，所述冷凍保護(hù)劑和含有所述細(xì)胞誘導(dǎo)劑的細(xì)胞培養(yǎng)液的體積比為1：2～20。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的角膜緣干細(xì)胞的制備方法，其特征在于，所述冷凍保護(hù)劑和含有所述細(xì)胞誘導(dǎo)劑的細(xì)胞培養(yǎng)液的體積比為1：2～10。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的角膜緣干細(xì)胞的制備方法，其特征在于，所述冷凍保護(hù)劑選自二甲基亞砜、甘油、乙二醇、丙二醇、乙酰胺、甲醇、聚乙烯吡咯烷酮、果糖、蔗糖、葡聚糖、白蛋白、聚乙二醇、乙基淀粉和卵黃中的一種或多種。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的角膜緣干細(xì)胞的制備方法，其特征在于，所述預(yù)處理包括：使用包含或不包含抗生素的生理緩沖液對(duì)待用角膜組織進(jìn)行常規(guī)清洗、消毒、分離；及/或，

所述角膜組織選自人、嚙齒類動(dòng)物和其他哺乳動(dòng)物的角膜組織中的任意一種或多種，所述角膜組織是新鮮角膜組織或者經(jīng)過短期保存的角膜組織中的任何一種，其中所述短期保存的時(shí)間為1天～20天。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的角膜緣干細(xì)胞的制備方法，其特征在于，所述分離培養(yǎng)的方法選自組織貼壁法和消化法中的一種或多種。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的角膜緣干細(xì)胞的制備方法，其特征在于，所述組織貼壁法包括如下步驟：從角膜組織中將角膜緣組織分離后，將角膜緣組織上皮層帖附在培養(yǎng)容器中培養(yǎng)，使角膜緣干細(xì)胞從角膜緣組織中遷出，獲得角膜緣干細(xì)胞。

8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的角膜緣干細(xì)胞的制備方法，其特征在于，所述消化法包括如下步驟：利用消化酶將包含角膜緣干細(xì)胞的角膜上皮層從角膜組織中消化分離，然后將角膜上皮層接種于培養(yǎng)容器中培養(yǎng)，獲得角膜緣干細(xì)胞。

9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的角膜緣干細(xì)胞的制備方法，其特征在于，還包含以下步驟：分離培養(yǎng)冷凍后的角膜組織，即得所述角膜緣干細(xì)胞。

10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的角膜緣干細(xì)胞的制備方法，其特征在于，用于所述培養(yǎng)的細(xì)胞培養(yǎng)液中添加有1ng/ml～100μg/ml所述細(xì)胞誘導(dǎo)劑。