[發明專利]一種基于流式細胞術檢測雞脾臟CD8+

有效

• 申請號: 201910405117.0
• 申請日: 2019-05-16
• 公開（公告）號: CN110196219B
• 公開（公告）日: 2022-06-03
• 發明（設計）人: 焦新安;唐娟;潘志明;胡茂志;康喜龍;孟闖;顧丹;王晶
• 申請（專利權）人: 揚州大學
• 主分類號: G01N15/14
• 分類號: G01N15/14;C12N5/0783
• 代理公司: 南京縱橫知識產權代理有限公司 32224
• 代理人: 薛海霞;董建林

1.一種基于流式細胞術檢測雞脾臟CD8⁺T細胞特異性殺傷作用的方法，其特征在于，可以單細胞水平檢測雞CD8⁺T細胞的特異性殺傷作用，包括如下步驟：

（1）細菌培養，所述的細菌為雞白痢沙門菌S06004和S06004ΔspiC；

（2）雞的免疫及采樣；

（3）靶細胞—巨噬細胞的制備，以分離的原代巨噬細胞作為靶細胞，更接近機體自然狀態，提供更準確的結果：

用淋巴細胞分離液分離雞外周血淋巴細胞，貼壁培養獲得巨噬細胞，取部分貼壁巨噬細胞用鼠抗雞巨噬細胞抗體標記，進行純度測定，剩余巨噬細胞接種于96孔板，培養過夜；

（4）效應細胞—雞脾臟CD8⁺T細胞的制備：包括雞脾臟淋巴細胞懸液的制備步驟和磁珠分選雞脾臟CD8⁺T細胞的步驟；

磁珠分選雞脾臟CD8⁺T細胞步驟具體為：用CD8α-APC和抗鼠IgG的磁珠分別作為一抗、二抗標記雞淋巴細胞，通過LS柱進行分離獲得雞脾臟CD8⁺T細胞，取部分雞脾臟CD8⁺T細胞進行純度測定；（5）CTL特異性殺傷巨噬細胞，通過流式細胞術檢測細胞凋亡，可以單細胞水平檢測特異性殺傷能力。

2.根據權利要求1所述的一種基于流式細胞術檢測雞脾臟CD8⁺T細胞特異性殺傷作用的方法，其特征在于，所述的步驟（1）具體為：挑取雞白痢沙門菌S06004，S06004ΔspiC單菌落接種于LB液體培養基中培養至對數生長期，調整細菌濃度。

3.根據權利要求1所述的一種基于流式細胞術檢測雞脾臟CD8⁺T細胞特異性殺傷作用的方法，其特征在于，所述的步驟（2）具體為：將3日齡雛雞隨機分成2組，分別肌肉注射免疫PBS和S06004ΔspiC。

4.根據權利要求1所述的一種基于流式細胞術檢測雞脾臟CD8⁺T細胞特異性殺傷作用的方法，其特征在于，雞脾臟淋巴細胞懸液的制備步驟具體為：將雞脾臟研磨過濾獲得淋巴細胞懸液，低速離心2次去除部分紅細胞，經淋巴細胞分離液分離獲得雞淋巴細胞。

5.根據權利要求1所述的一種基于流式細胞術檢測雞脾臟CD8⁺T細胞特異性殺傷作用的方法，其特征在于，步驟（5）具體為：將細菌S06004加到過夜培養的巨噬細胞中，離心、培養1h，加入含100 μg/mL慶大霉素的培養基培養1 h殺死巨噬細胞外的細菌；更換含10 μg/mL慶大霉素的培養基抑制胞外細菌的增殖、繼續培養5 h，隨后加入脾臟CD8⁺T細胞，共同培養24h，收取細胞，檢測靶細胞的凋亡情況，評價雞脾臟CD8⁺T細胞特異性殺傷作用。

6.如權利要求1-5任一項所述基于流式細胞術檢測雞脾臟CD8⁺T細胞特異性殺傷作用的方法可用于沙門菌疫苗免疫效果及細胞免疫應答的評價。