[發(fā)明專利]一種用于生物柴油生產(chǎn)的小球藻藻株的篩選方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201910402777.3
• 申請(qǐng)日: 2019-05-15
• 公開（公告）號(hào): CN110157622A
• 公開（公告）日: 2019-08-23
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 楊凱;戰(zhàn)景明;劉占旗;楊彪;蘇麗霞;姜霞;王秀琴;周文明
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國輻射防護(hù)研究院
• 主分類號(hào): C12N1/12
• 分類號(hào): C12N1/12;C12Q1/6895;C12Q1/04;C12R1/89
• 代理公司: 北京天悅專利代理事務(wù)所(普通合伙) 11311
• 代理人: 田明;任曉航

1.一種用于生物柴油生產(chǎn)的小球藻藻株的篩選方法，其特征在于：該篩選方法包括以下步驟：

S1.采集水樣，進(jìn)行增殖培養(yǎng)：

S2.采用BG11固體培養(yǎng)板分離方法對(duì)采集的水樣中的藻株進(jìn)行分離；

S3.對(duì)分離后的藻株進(jìn)行純化培養(yǎng)，并對(duì)培養(yǎng)得到的微藻藻株進(jìn)行編號(hào)，觀察藻株形成的藻落的形狀、顏色；

S4.將純化培養(yǎng)得到的藻株在BG11培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)至指數(shù)生長期，適當(dāng)稀釋后直接在光學(xué)顯微鏡下觀察，記錄藻細(xì)胞的形態(tài)特征；

S5.收集指數(shù)生長期藻細(xì)胞，用植物基因組DNA提取試劑盒提取基因組DNA，以其作為模板，利用PCR技術(shù)擴(kuò)增18SrDNA基因片段；擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳分離后測(cè)序，確定藻株的屬名；

S6.基于測(cè)序得到的18SrDNA序列用軟件MEGA4.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，確定藻株的種名。

2.一種如權(quán)利要求1所述的用于生物柴油生產(chǎn)的小球藻藻株的篩選方法，其特征在于，步驟S1的具體方法如下：從淡水河流中采集水樣，用紗布過濾掉所采集的水樣中的肉眼可見的沙石和浮游生物，取一定體積的過濾后的水樣，加入裝有BG11液體培養(yǎng)基的三角瓶?jī)?nèi)，將三角瓶置于光照培養(yǎng)箱內(nèi)，靜置培養(yǎng)7天，培養(yǎng)溫度為25±1℃，光照強(qiáng)度為2500LX左右，光照時(shí)間為24h，每天定時(shí)晃動(dòng)4次。

3.一種如權(quán)利要求2所述的用于生物柴油生產(chǎn)的小球藻藻株的篩選方法，其特征在于，所述水樣與培養(yǎng)基的體積比為1：2，水樣的體積為25mL，培養(yǎng)基的體積為50mL。

4.一種如權(quán)利要求1所述的用于生物柴油生產(chǎn)的小球藻藻株的篩選方法，其特征在于，步驟S2中，所述BG11固體培養(yǎng)板的制作方法如下：在BG11液體培養(yǎng)基內(nèi)加入1.5％的瓊脂，加熱溶解后，分裝到三角燒瓶?jī)?nèi)，置于高壓蒸汽滅菌鍋內(nèi)滅菌，溫度121℃，時(shí)間20-30min，待培養(yǎng)基冷卻到50℃左右時(shí)，利用無菌操作將培養(yǎng)基倒入到滅菌的培養(yǎng)皿中，冷卻后制成BG11固體培養(yǎng)板。

5.一種如權(quán)利要求1所述的用于生物柴油生產(chǎn)的小球藻藻株的篩選方法，其特征在于，步驟S2中所述分離的具體操作如下：在無菌條件下，取S1中的培養(yǎng)液搖勻后，用經(jīng)過酒精燈滅菌的接種環(huán)蘸取藻樣輕輕地在培養(yǎng)基平面上做第一次劃線，劃3-4條，將培養(yǎng)皿旋轉(zhuǎn)約80^o，把接種環(huán)在酒精燈上滅菌后通過第一次劃線區(qū)做第二次劃線，用同樣的方法做第三次、第四次劃線。

6.一種如權(quán)利要求1所述的用于生物柴油生產(chǎn)的小球藻藻株的篩選方法，其特征在于，步驟S3中純化培養(yǎng)的具體方法如下：BG11固體培養(yǎng)板經(jīng)接種后，置于光照培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，培養(yǎng)過程中觀察藻株是否有雜菌污染，培養(yǎng)7天后用纖細(xì)的解剖針挑取未被污染的單藻落，接種于裝有培養(yǎng)基的三角瓶中，置于光照培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)，每天定時(shí)搖動(dòng)4次，觀察培養(yǎng)液的顏色變化，待培養(yǎng)液顏色較綠時(shí)，吸取5mL藻液按1：10的接種比例進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，并對(duì)培養(yǎng)得到的微藻藻株進(jìn)行編號(hào)，觀察藻株形成的藻落的形狀、顏色。

7.一種如權(quán)利要求1所述的用于生物柴油生產(chǎn)的小球藻藻株的篩選方法，其特征在于，步驟S5中PCR反應(yīng)體系為25ul，其中含濃度為10umol/L的正、反向引物各0.5ul，模板DNA0.5ul，dNTP1ul，酶0.2ul；循環(huán)條件為：95℃預(yù)變性4min，94℃變性45s，55℃復(fù)性45s，72℃延伸1min，30個(gè)循環(huán)后，72℃延伸10min。

8.一種如權(quán)利要求1所述的用于生物柴油生產(chǎn)的小球藻藻株的篩選方法，其特征在于，步驟S5中用于擴(kuò)增18SrRNA的引物為通用引物，序列為：

正向引物：5’-CCT GGT TGA TCC TGC CAG-3’

反向引物：5’-TTG ATC CTT CTG CAG GTT CA-3’。

9.一種如權(quán)利要求1所述的用于生物柴油生產(chǎn)的小球藻藻株的篩選方法，其特征在于，步驟S5測(cè)序是指將電泳分離后所得的序列在Genbank數(shù)據(jù)庫中做BLASTn。

10.一種如權(quán)利要求1所述的用于生物柴油生產(chǎn)的小球藻藻株的篩選方法，其特征在于，步驟S6的具體方法為：測(cè)序得到的18SrDNA序列用軟件MEGA4.0進(jìn)行對(duì)位排列，比對(duì)中采用默認(rèn)設(shè)置，比對(duì)后對(duì)結(jié)果進(jìn)行手工調(diào)整，調(diào)整后約1.7kb的序列用軟件MEGA4.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。