[發(fā)明專利]一種I群4型禽腺病毒全懸浮的培養(yǎng)方法

在審

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• 申請日: 2019-05-15
• 公開（公告）號: CN110042085A
• 公開（公告）日: 2019-07-23
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 董婷婷;徐宏軍;楊碧濤;李義星;張孝智;姜磊;王麒文;肖龍;張敏;高杰
• 申請（專利權(quán)）人: 青島蔚藍生物制品有限公司
• 主分類號: C12N7/00
• 分類號: C12N7/00;C12N7/02;C12M3/00;C12M1/34;C12M1/04
• 代理公司: 青島致嘉知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 37236
• 代理人: 單虎

1.一種I群4型禽腺病毒全懸浮的培養(yǎng)方法，其特征在于，包括：

步驟1：制苗用細胞的傳代與接種

將馴化的全懸浮LMH-s細胞復(fù)蘇、傳代培養(yǎng)后取樣計數(shù)，用含10％FBS的DMEM生長液將LMH-s細胞調(diào)整為0.5×10⁶個cells/ml，再接種到生物反應(yīng)器上進行培養(yǎng)；

步驟2：制苗用種毒的制備

將在生物反應(yīng)器中培養(yǎng)的LMH-s細胞接種禽腺病毒，然后加入維持液，接毒后繼續(xù)培養(yǎng)；接毒后細胞培養(yǎng)一段時間后補加TPCK-胰酶；在細胞培養(yǎng)48h時取病毒液測定TCID₅₀，之后每隔12h取樣檢測一次，至接毒后96h，將收獲的病毒液進行無菌檢驗和效力檢驗，作為生產(chǎn)用種毒；

步驟3：禽腺病毒在生物反應(yīng)器中的全懸浮培養(yǎng)

取生長良好的LMH-s細胞計數(shù)后接種到生物反應(yīng)器中，進行生物反應(yīng)器全懸浮培養(yǎng)；細胞培養(yǎng)后72h后，按體積比1-2％接種步驟2的毒種，打入總體積50％的維持液，按步驟2繼續(xù)培養(yǎng)；

步驟4：病毒的收獲與效價檢測

維持液培養(yǎng)后約72h后停止攪拌，此時將培養(yǎng)液全部收獲，凍融一次后保存。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的I群4型禽腺病毒全懸浮的培養(yǎng)方法，其特征在于，所述步驟1中，生物反應(yīng)器容積為2L-200L，生物反應(yīng)器在使用前需要進行電極校正、滅菌、平衡，具體方法如下；

(1)生物反應(yīng)器的準備：

根據(jù)培養(yǎng)的體積選擇合適的生物反應(yīng)器，連接好各種管道和補料，換液的接口，接上溫度、pH、DO電極，對電極進行校正；

(2)氣密性檢查：

反應(yīng)器中裝入適量的PBS，通關(guān)閉出氣口，向罐內(nèi)補氣，停止補氣后看壓力維持情況，檢查罐體和連接瓶的氣密性；

(3)滅菌：

滅菌前認真檢查各管道和接頭確保連接完好后進行氣密性測試，測試合格后方可準備進行滅菌；根據(jù)生物反應(yīng)器的規(guī)模，5L及5L以下一般采用離線滅菌，在高壓鍋中121℃高壓30min，滅菌結(jié)束后取出自然冷卻；50L及50L以上的生物反應(yīng)器通常采用在位滅菌的方式滅菌。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的I群4型禽腺病毒全懸浮的培養(yǎng)方法，其特征在于，所述生物反應(yīng)器的培養(yǎng)條件為：溫度為37.0℃，pH值為7.20，DO為40％，轉(zhuǎn)速為80rpm。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的I群4型禽腺病毒全懸浮的培養(yǎng)方法，其特征在于，所述步驟2中，LMH-s細胞生長液與接種禽腺病毒的體積比為1-1.5％；LMH-s細胞生長液與維持液的體積比為50-60％。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的I群4型禽腺病毒全懸浮的培養(yǎng)方法，其特征在于，所述維持液為含血清1％的DMEM溶液，pH為7.20。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的I群4型禽腺病毒全懸浮的培養(yǎng)方法，其特征在于，所述步驟2中，接毒后在細胞培養(yǎng)33h時補加5mg/L的TPCK-胰酶；在細胞培養(yǎng)約48h時取病毒液測定TCID₅₀，之后每隔12h取樣檢測一次。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的I群4型禽腺病毒全懸浮的培養(yǎng)方法，其特征在于，所述TPCK-胰酶為濃度為1.25mg/L的胰酶細胞生長液，細胞生長液為體積比例為90％的DMEM和體積比例為10％的FBS的混合液。

8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的I群4型禽腺病毒全懸浮的培養(yǎng)方法，其特征在于，所述步驟3中，起始細胞密度調(diào)整為0.5×10⁶個cells/ml，生物反應(yīng)器設(shè)定如下參數(shù)溫度37℃、pH7.2、攪拌速度80rpm、溶氧含量40％進行反應(yīng)器自動控制培養(yǎng)。