[發明專利]腦脊液VGF蛋白試劑盒及其在髓母細胞瘤轉移評定中的應用

在審

• 申請號: 201910400485.6
• 申請日: 2019-05-14
• 公開（公告）號: CN111948398A
• 公開（公告）日: 2020-11-17
• 發明（設計）人: 姚瑜;王玉元;鐘平;唐超;李捷
• 申請（專利權）人: 復旦大學附屬華山醫院
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68
• 代理公司: 上海元一成知識產權代理事務所(普通合伙) 31268
• 代理人: 吳桂琴

本發明屬生物技術領域，涉及腫瘤診斷試劑盒，具體涉及腦脊液VGF蛋白劑盒及其在髓母細胞瘤轉移檢測預判中的應用。本發明中設計了包括鼠抗人VGF生物素標記單抗、鏈霉素抗生素蛋白?過氧化酶工作液等組分的試劑盒，然后通過ELISA的方法，對采集的腦脊液樣本進行檢測，根據腦脊液中VGF濃度做出相應的診斷，當VGF濃度降低至術后三分之一時，可初步判斷為髓母細胞瘤腦脊液轉移。本發明方法應用于髓母細胞瘤預測的診斷，不僅可以對高危人群進行篩查，而且能夠指導腫瘤分期，為尋找靈敏、特異的髓母細胞瘤腦脊液標志物提供基礎。

技術領域

本發明屬生物技術領域，涉及腫瘤診斷試劑盒，具體涉及腦脊液VGF蛋白試劑盒及其在髓母細胞瘤轉移評定中的應用。所述試劑盒通過檢測腦脊液中的VGF蛋白，為尋找靈敏、特異的髓母細胞瘤轉移腦脊液標志物提供基礎。

背景技術

現有技術公開了髓母細胞瘤是最常見的兒童惡性腦腫瘤，約占兒童腫瘤的20％，成人發生該疾患后預后亦很差，髓母細胞瘤已成為是危害人們身體健康的重大腦疾病。2016WHO將髓母細胞瘤按照不同分子亞型：SHH，WNT，GROUP3，GROUP4。目前髓母細胞瘤的標準治療方案為：手術切除+術后放療+術后化療，患者5年生存率為52％，而出現遠處轉移病人5年生存率僅為26％，腫瘤轉移時髓母細胞瘤常見的致死原因之一。因此，如何能夠對髓母細胞瘤病人術后出現轉移進行預測，以便及時調整術后放化療計量、延長患者生存期，成為越來越多的科學家和醫生關注的課題。

目前對于髓母細胞瘤轉移的分級仍然采用1969年的chang分級，該分級根據患者的影像學及腦脊液脫落細胞學為依據對髓母細胞瘤進行分級。由于當時技術及相關研究的缺乏，缺乏對髓母細胞瘤病人腦脊液成分及生物信息認知，chang分級尚不能對髓母細胞瘤病人轉移起到預測的作用。目前國際上對于髓母細胞瘤轉移病人腦脊液成分研究少之又少，轉移病人的預測研究迫在眉睫。

研究公開了蛋白質作為動物生命活動的基礎，在人類各個生物過程起到至關重要的作用。同樣的，腫瘤的轉移也與蛋白質和相關肽段的參與相關。髓母細胞瘤轉移往往是通過腫瘤細胞混雜在腦脊液中，延蛛網膜下腔播散，最后定植在脊髓或者中樞神經系統以外的各個系統。因此，設法檢測髓母細胞瘤腦脊液蛋白的變化來預判髓母細胞瘤轉移的可能是可行的。

基因測序技術的變革使針對患者的個體化分析以及相應的個體化治療成為可能，精準醫療隨之而產生。然而，疾病的發生來自于遺傳與后天環境兩方面，建立在基因測序基礎上的、僅考慮遺傳因素的精準醫療注定不能到達“精準”，何況遺傳性致病因素要由基因轉化為蛋白缺陷方能得以致病。因此，無論從驗證基因缺陷角度還是從環境致病因素角度，蛋白質分析必將是精準醫療的下一個里程碑。蛋白質譜技術，即通常被成為液相－質譜聯用(液質聯用，LC/MS/MS)，是獨立于抗體技術之外的兩大蛋白質分析技術之一，其原理是以肽段在色譜柱中的保留時間(Retention time，RT)和肽段及其在高能碎裂后的離子特征(質量/電荷比例，即質荷比m/z)推導被檢肽段的氨基酸序列，由于被檢肽段是來自特定酶解后某蛋白質，因而可以根據多個含有特征氨基酸序列的肽段，推導該蛋白質的存在(即鑒定，identification)。繼而可以根據肽段離子(又稱為母離子，precursor ion)及其碎裂離子(又稱為子離子，fraction ion)在質譜中的響應程度對肽段及其對應的蛋白質進行定量。2014年末，《Nature Methods》雜志介紹了了2015年值得關注的技術，其中就包括DIA質譜分析技術。傳統從液態中識別蛋白質采用的是：數據依賴液態活檢方法(DDA)，它將蛋白質樣品消化成肽段，離子化并通過質譜進行分析。在全掃描質譜圖中，高于噪音的肽段信號被選擇性裂解，產生隨機(MS/MS)質譜，能夠與數據庫中的圖譜相匹配。數據依賴液態活檢方法(DIA)：在DDA的基礎上掃描范圍內對母離子進行無縫碎裂，相比DIA能夠采集到更多更全的信息。這實現了準確的肽段定量，而不限于分析預先定義的肽段。新型的DIA方法能幫助我們更全面的分析腦脊液中肽段及蛋白。