[發明專利]小鼠乳腺癌循環腫瘤細胞系及其建立方法

有效

• 申請號: 201910396716.0
• 申請日: 2019-05-14
• 公開（公告）號: CN110079501B
• 公開（公告）日: 2023-03-21
• 發明（設計）人: 李敏;金延玲;武雯程;羅晶;徐凱
• 申請（專利權）人: 蘭州大學
• 主分類號: C12N5/09
• 分類號: C12N5/09;A01K67/027
• 代理公司: 北京興智翔達知識產權代理有限公司 11768
• 代理人: 郭衛芹

本發明提供小鼠乳腺癌循環腫瘤細胞系4T1?CTC，于2019年4月10日保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCC NO：C201930。本發明還提供小鼠乳腺癌循環腫瘤細胞的分離和培養方法。本發明分離并培養獲得的循環腫瘤細胞質量均一，經過免疫熒光、增殖、侵襲遷移及致瘤能力實驗鑒定符合循環腫瘤細胞的特性，是實驗室研究腫瘤轉移較好的實驗對象，也為臨床預測乳腺癌轉移、檢測化療藥物敏感性提供了良好的研究模型。本發明的循環腫瘤細胞分離及培養方法簡單，成本低，易于操作，分離的細胞可傳代，為實驗室研究循環腫瘤細胞特性、腫瘤轉移機制提供了很好的研究工具。本發明在腫瘤轉移研究方面將會有廣泛的應用。

技術領域

本發明屬于生物技術技術領域，具體涉及小鼠乳腺癌循環腫瘤細胞系及乳腺癌循環腫瘤細胞的分離和培養方法。

背景技術

乳腺癌是最常見的女性惡性腫瘤，并且是女性腫瘤相關死亡的主要原因，據2015年統計，在中國有大約27萬乳腺癌新增病例，大約7萬患者死亡，腫瘤轉移是導致腫瘤患者死亡的主要原因，而循環腫瘤細胞在腫瘤血道轉移過程中起到了關鍵作用。國內外大量研究證實乳腺癌患者血液中循環腫瘤細胞與患者臨床分期、預后及腫瘤轉移復發密切相關。2018年美國AJCC指南中將循環腫瘤細胞列為乳腺癌預后評估的一項生物學指標。故循環腫瘤細胞的早期捕獲對于患者預后判斷、療效評價和個體化治療都具有重要的指導作用。

循環腫瘤細胞的檢測有創傷小易重復的優點，故循環腫瘤細胞的捕獲、分離及培養技術是關鍵環節。目前為止，尚未見到小鼠乳腺癌循環腫瘤細胞系建立的報道。

發明內容

為了解決現有技術中存在的問題，本發明提供了小鼠乳腺癌循環腫瘤細胞系及乳腺癌循環腫瘤細胞的分離和培養方法。

本發明提供小鼠乳腺癌循環腫瘤細胞系4T1-CTC，于2019年4月10日保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCC NO：C201930。

本發明提供小鼠乳腺癌循環腫瘤細胞的分離和培養方法，包括以下步驟：

(1)取乳腺癌原位轉移瘤小鼠模型的外周血至枸櫞酸鈉抗凝劑中，得到抗凝血，將抗凝血輕輕移至含有小鼠外周血淋巴細胞分離液的離心管中，離心，吸取血漿及白細胞層至無菌離心管中，用無菌PBS液漂洗后離心，獲得細胞沉淀；

(2)將步驟(1)得到的細胞轉移至含有10％FBS的DMEM1640培養基的培養瓶中，置于37℃，5％CO₂細胞培養箱中培養；培養24h-48h后，更換培養液，之后每48h更換一次培養液，通過更換培養液將懸浮的白細胞清除，得到貼壁生長的細胞，即為小鼠乳腺癌循環腫瘤細胞。

作為優選，步驟(1)中，所述乳腺癌原位轉移瘤小鼠模型的建立方法包括以下步驟：用無菌PBS重懸處于對數生長期的乳腺癌細胞系4T1單細胞，接種至小鼠模型,注射至小鼠模型乳腺脂肪墊，飼養35天到40天，至小鼠模型出現消瘦、衰竭狀態。

作為優選，步驟(1)中，所述小鼠模型為SPF級BALB/c小鼠。

作為優選，步驟(2)中，所述DMEM1640培養基中還加入1％青鏈霉素。

作為優選，步驟(2)中，待貼壁生長的小鼠乳腺癌循環腫瘤細胞系細胞密度達到70-80％時開始傳代培養。

作為優選，所述傳代培養的具體方法為：棄掉培養液，用無菌PBS液漂洗后，以0.25％胰蛋白酶溶液于室溫消化，當細胞變圓后，加入含有10％FBS的DMEM1640培養液將細胞吹散制備為單細胞懸液，然后將細胞懸液移至培養瓶中，置于37℃，5％CO₂培養箱中繼續培養。

作為優選，所述小鼠乳腺癌循環腫瘤細胞的凍存方法為：將處于對數生長期的小鼠乳腺癌循環腫瘤細胞用0.25％的胰蛋白酶溶液于室溫消化為單細胞，離心獲得細胞沉淀，緩慢加入細胞凍存液，于4℃放置1h，-20℃放置2h，-80℃放置過夜，次日在液氮中保存。