[發明專利]一種基因治療安全評估與毒副作用預防的方法

在審

• 申請號: 201910388932.0
• 申請日: 2019-05-10
• 公開（公告）號: CN111909986A
• 公開（公告）日: 2020-11-10
• 發明（設計）人: 潘雨堃
• 申請（專利權）人: 潘雨堃
• 主分類號: C12Q1/6848
• 分類號: C12Q1/6848;C12Q1/6869
• 代理公司: 上海精晟知識產權代理有限公司 31253
• 代理人: 馮子玲

本發明提供一種基因治療安全評估與毒副作用預防的方法，本發明在評估整合型載體介導基因治療安全性時所采取的技術方案是利用Splinkerette?PCR和illumina高通量測序定位整合型基因治療載體在靶細胞中的插入位點從而判斷有無原癌基因被激活。本發明能夠評估基因治療的安全性，另一方面提供了一種利用預設的可誘導性自殺基因清除癌變靶細胞的技術在相關安全風險存在時用于規避毒副作用。

技術領域

本發明涉及一種基因治療安全評估與毒副作用預防的方法，屬于基因檢測領域。

背景技術

基因治療是從DNA水平治療人類疾病的治療手段，具體地是將人的正常基因或有治療作用的基因通過特定的基因治療載體轉移導入人體靶細胞以糾正基因的缺陷或者發揮治療作用，從而達到治療疾病的目的。

根據是否介導治療基因整合入人體靶細胞基因組，基因治療載體可分為整合型載體和非整合型載體。其中，整合型載體具體包括：逆轉錄病毒、慢病毒、PhiC31整合酶，Sleeping Beauty和piggyBac轉座子。現有的整合型基因治療載體大多介導治療基因隨機插入基因組，故存在誘導隨機插入突變、引發細胞癌變的風險。從2002年開始，法國巴黎的研究人員陸續地報告了患者在運用逆轉錄病毒載體治療重癥聯合免疫缺陷(SCID)后患上白血病樣疾病的病例。當逆轉錄病毒載體不恰當地插入了基因組中與淋巴細胞增殖相關的原癌基因附近時，會激活原癌基因，導致淋巴細胞異常擴增(Hacein-Bey-Abina等，2003，Science 302：415-419；Hacein-Bey-Abina等，2008，J.Clin.Invest.118：3132-3142)。其他整合型基因治療載體也同樣存在插入突變誘導癌變的安全風險(Cavazzana-Calvo等，2010，Nature 467：318-322)。

迄今為止，在基因治療領域仍缺乏一種可用于系統地評估整合型載體安全性并規避潛在風險毒副作用的方法。

發明內容

為了有效地評估整合型載體基因治療的安全性并預防潛在毒副作用，本發明提供了一種利用高通量插入突變定位技術評估整合型載體介導基因治療安全性，以及在相關安全風險存在時利用預設的可誘導性自殺基因規避毒副作用的方法。

本發明采用了如下技術方案：

本發明在評估整合型載體介導基因治療安全性時所采取的技術方案是利用Splinkerette-PCR和illumina高通量測序定位整合型基因治療載體在靶細胞中的插入位點從而判斷有無原癌基因被激活，具體的步驟是：

1)提取攜帶整合型基因治療載體的靶細胞的基因組，酶切獲得DNA片段并在兩端連接加上Splinkerette接頭寡核苷酸，多聚酶鏈式反應(PCR)擴增整合型載體插入位點旁基因組序列，隨后通過巢式PCR進一步擴增插入位點旁的基因組序列并在引物中加入illumina接頭序列。

2)illumina高通量測序獲得整合型載體隨機插入位點旁的基因組序列信息，定位整合型基因治療載體在靶細胞中的插入位點，判斷有無插入位點位于原癌基因附近并激活原癌基因的可能。

本發明在相關安全風險存在時規避毒副作用所采取的技術方案是利用預設的可誘導型自殺基因iCaspase9清除癌變的靶細胞，具體的步驟是：

1)將iCaspase9基因與治療基因串聯在同一DNA分子內并通過2A肽連接，裝入整合型基因治療載體內，從而使得轉錄得到的單一信使RNA可以同時過表達iCaspase9基因與治療基因。

2)在相關安全風險存在時為規避毒副作用，體內注射AP1903藥物激活自殺基因，清除癌變的靶細胞。

進一步，本發明的規避基因治療毒副作用的預防方法：