[發明專利]一種增強蛋白降解多肽的發現及應用

有效

• 申請號: 201910383227.1
• 申請日: 2019-05-09
• 公開（公告）號: CN110092838B
• 公開（公告）日: 2023-03-10
• 發明（設計）人: 尹秀山;李學龍;李根
• 申請（專利權）人: 拜澳泰克（沈陽）生物醫學集團有限公司
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;G01N33/68
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發明公開了一種增強目的蛋白降解的多肽。所述多肽信息包括編碼多肽的cDNA序列，RNA序列和蛋白序列及其延伸序列、修飾過的氨基酸序列以及同5源性不低于70%的蛋白序列。本發明還提供了一種增強蛋白降解多肽的應用，通過與目的蛋白融合，該多肽可以特異增強自身降解并可以介導融合蛋白的共降解，其降解程度顯著，可以達到近乎敲除的效果。該多肽可用做調控蛋白水平的工具，在體外或者體內調節融合蛋白的表達水平來研究其功能和調節生物學通路。該多肽可以通過體內和體外合成得到，方便快捷，為今后關于蛋白聚集疾病的治療提供新的途徑和方法。

技術領域

本發明涉及基因工程技術領域，特別涉及一種增強蛋白降解的多肽及其應用。

背景技術

蛋白穩定性的調控發揮重要的生物學功能。在體內，蛋白穩定性失調與眾多疾病相關。由于蛋白質聚集體的形成而促發的疾病被稱為蛋白質聚集疾病。其中最常見的是神經退行性疾病，如蛋白質異常聚集并沉積在大腦的特定區域并阻礙其功能（參考文獻：Protein aggregation and neurodegenerative diseases: From theory to therapy）。蛋白降解主要有蛋白酶體介導的泛素級聯反應以及溶酶體介導的降解途徑。其中泛素化在癌癥，代謝綜合癥，神經退行性疾病，自身免疫疾病，炎癥性失常，感染和肌肉營養不良的蛋白穩定調控方面發揮重要作用（參考文獻：Ubiquitination in disease pathogenesisand treatment）。通過激活（E1），結合（E2）和連接（E3）酶進行的級聯酶促反應，特異的蛋白序列被識別，標記，在特定信號通路的調解下，使得目的蛋白得到精確的降解（參考文獻：The ubiquitin system）。特定的蛋白序列可以在體外作為一種標簽，通過與要研究的目的蛋白融合介導其快速地酶解來研究其功能和調節生物學通路。直接靶向蛋白質的方法比靶向DNA和RNA的方法在在特異性，可逆性和時間方面上具有優勢（參考文獻：ConditionalDegrons for Controlling Protein Expression at the Protein Level）。

發明內容

本發明設計一種增強蛋白降解的多肽及其應用，具體為該多肽及同源多肽的序列，及作為標簽，調節融合目的蛋白穩定性的方法。

本發明包括蛋白降解多肽J100的序列、包括J100的延伸序列、修飾過的氨基酸序列以及同源性不低于70%的蛋白序列。通過與目的蛋白融合，我們發現該降解多肽J100具有調控融合蛋白共同降解的功能，因此該降解多肽J100可以作為一種多肽標簽，應用在分子生物學及細胞生物學領域。

附圖說明

圖1為J1-J6截短體的蛋白表達情況。圖中，左側為截短體western blot檢測目的蛋白的表達；右側為待檢測蛋白的區域示意圖，星號表示表達強度，灰色為表達，黑色為不表達。

具體實施方式

下文分別提供降解多肽J100鑒定過程及方法，以及與熒光蛋白tdTomato融合從而增強tdTomato降解的效果。降解多肽J100的鑒定過程及方法，以及對熒光蛋白的促降解作用，并不以任何方式限制本發明的范圍。

1，降解多肽J100的鑒定及方法

HEK293細胞常規培養，培養條件為 5%二氧化碳培養箱，37度恒溫。培養基為DMEM，雙抗， 10%血清和L-谷氨酰胺。細胞生長到50%-80%時，進行轉染，轉染方法參照脂質體2000的說明，轉染兩到四天后收集細胞，裂解后按照每孔上樣10 μg進行western blot，利用flag抗體進行檢測目的蛋白的表達情況。

利用高通量篩選方法，我們發現一段蛋白序列J2 （圖1 所示）顯著影響蛋白穩定，Flag標簽無法檢測到J2的表達。通過截短體篩選，最終將影響蛋白穩定性的序列鎖定到100aa內（見圖1 中J5與J6的表達）。本實驗鑒定到了降解多肽J100。

2，降解多肽J100對熒光蛋白tdTomato的促降解作用