[發明專利]利用5-氮雜胞嘧啶核苷提高大豆抗性叢生芽誘導效率的方法

在審

• 申請號: 201910376002.3
• 申請日: 2019-05-07
• 公開（公告）號: CN110042120A
• 公開（公告）日: 2019-07-23
• 發明（設計）人: 趙明哲;趙強;謝甫綈
• 申請（專利權）人: 沈陽農業大學
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82
• 代理公司: 大連智高專利事務所(特殊普通合伙) 21235
• 代理人: 李楠

本發明涉及利用5?氮雜胞嘧啶核苷提高大豆抗性叢生芽誘導效率的方法，屬于轉基因技術領域。主要技術方案如下：滅菌、萌發、配制農桿菌菌液、農桿菌侵染大豆子葉節、抗性叢生芽誘導。本發明首次在農桿菌介導的大豆子葉節遺傳轉化體系中，使用甲基化抑制劑5?氮雜胞嘧啶核苷對誘導抗性叢生芽的大豆子葉外植體進行去甲基化處理，提高了大豆子葉外植體的抗性叢生芽的誘導效率，這可能會導致T0代轉化效率的提高。

技術領域

本發明涉及轉基因技術領域，具體涉及利用5-氮雜胞嘧啶核苷提高大豆抗性叢生芽誘導效率的方法。

背景技術

大豆是我國主要的食用油、食用蛋白質和飼料作物，其產量和品質的改良對經濟和農業產業具有重要意義。運用常規育種方法進行的大豆品質改良具有培育周期長，操作繁瑣，種間配合力差等缺點，而轉基因技術提供了一種打破物種壁壘的有效方法，極大的促進了作物的遺傳改良進程，從而加速了高質量/高產作物品種的選擇過程。近些年來轉基因技術得到了長足的發展，但是與其他物種相比，大豆轉化效率低下是制約大豆基因功能研究的一個技術屏障，限制了其商業化發展。因此，建立高效的大豆轉基因體系將對大豆功能基因組學的研究和轉基因技術的發展具有重要意義。

農桿菌介導的遺傳轉化是最有效和最廣泛應用的大豆遺傳轉化方法。然而，以往的研究表明農桿菌介導的大豆轉化效率與大豆基因型密切相關，這一特點顯著限制了轉基因技術在一些具有良好農藝性狀的品種中的應用。目前主要通過篩選高轉化效率的大豆品種來解決大豆轉基因效率低下問題，但是缺少有效的方法來提高低轉化效率品種的轉化效率。

發明內容

為彌補現有技術的不足，本發明提供一種利用5-氮雜胞嘧啶核苷提高大豆抗性叢生芽誘導效率的方法。通過在農桿菌介導的大豆遺傳轉化體系中的抗性叢生芽誘導培養基中添加DNA甲基化抑制劑5-氮雜胞嘧啶核苷(5-Azacytidine)來提高低轉化效率大豆品種的抗性叢生芽的誘導效率，以期提高低轉化效率大豆品種的轉基因效率。

本發明的技術方案如下：利用5-氮雜胞嘧啶核苷提高大豆抗性叢生芽誘導效率的方法，包括以下步驟：

(1)大豆種子滅菌

(2)大豆種子萌發

(3)配制農桿菌菌液

(4)農桿菌侵染大豆子葉節

(5)抗性叢生芽誘導

將大豆的子葉近軸面向上，斜插入到抗性叢生芽誘導培養基中，26℃下光周期培養，每7天更換新的培養基，培養2周，即可得到抗性叢生芽；在誘導培養過程中，添加8-50μM5-氮雜胞嘧啶核苷到抗性叢生芽誘導培養基。

進一步的，步驟(5)所述斜插的角度為45°。

進一步的，在誘導培養第二周添加8-50μM 5-氮雜胞嘧啶核苷到抗性叢生芽誘導培養基。

進一步的，在誘導培養第一周、第二周均添加8-50μM 5-氮雜胞嘧啶核苷到抗性叢生芽誘導培養基。

進一步的，在誘導培養第一周添加8-50μM 5-氮雜胞嘧啶核苷到抗性叢生芽誘導培養基。

進一步的，在誘導培養第二周添加10μM 5-氮雜胞嘧啶核苷到抗性叢生芽誘導培養基。

進一步的，所述抗性叢生芽誘導培養基的配方如下：3.21g/L B5基礎培養基、30g/L蔗糖、18mM 2-(N-嗎啉)乙磺酸一水合物、7.5uM 6-芐基氨基嘌呤、5mg/L草丁膦、3g/L凝膠，調節pH為5.8。