[發明專利]利用雙重數字PCR定量檢測蓮蓉中蕓豆成分的方法有效
| 申請號： | 201910375438.0 | 申請日： | 2019-05-07 |
| 公開（公告）號： | CN110317858B | 公開（公告）日： | 2022-09-13 |
| 發明（設計）人： | 劉津;董旭婉;董潔;席靜;高東微;李志勇;關麗軍 | 申請（專利權）人： | 廣州海關技術中心 |
| 主分類號： | C12Q1/6851 | 分類號： | C12Q1/6851;C12Q1/6895 |
| 代理公司： | 廣州新諾專利商標事務所有限公司 44100 | 代理人： | 劉婉 |
| 地址： | 510623 廣東省廣州市*** | 國省代碼： | 廣東;44 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 利用 雙重 數字 pcr 定量 檢測 蓮蓉 蕓豆 成分 方法 | ||
1.一種利用雙重數字PCR定量檢測蓮蓉中蕓豆成分的方法，其特征在于：采用雙通道檢測法，利用數字PCR系統同時探測兩種熒光信號，將蕓豆物種特異性基因序列和蓮子物種特異性基因序列檢測的探針分別標記為VIC和FAM，通過在同一PCR反應體系中測得的所述蕓豆物種特異性基因序列和所述蓮子物種特異性基因序列的拷貝數濃度，計算得到蕓豆占蓮子和蕓豆總成分的DNA拷貝數百分比，換算得到蕓豆成分占蓮子和蕓豆總成分的質量百分比；
所述方法包括以下步驟：
步驟1.提取蓮蓉樣品DNA；
步驟2.設計并合成所述蓮子物種特異性基因序列的引物和探針序列以及所述蕓豆物種特異性基因序列的引物和探針序列；
步驟3.進行雙重數字PCR反應；
步驟4. 采用FAM和VIC雙通道熒光檢測讀取并分析熒光信號；
步驟5.根據熒光信號檢測結果計算所述蕓豆占蓮子和蕓豆的DNA拷貝數百分比，換算得到蕓豆成分占蓮子和蕓豆成分的質量百分比；
其中，所述蕓豆占蓮子和蕓豆的DNA拷貝數百分比，其中a為蕓豆特異性基因拷貝數濃度，b為蓮子特異性基因拷貝數濃度；
其中，所述蕓豆成分占蓮子和蕓豆成分的質量百分比，通過建立其對拷貝數百分比的關系式，利用拷貝數百分比求得；
所述步驟2中，所述蓮子物種特異性基因序列的引物和探針序列如下：
蓮子特異性基因-F：CTTCCCTTGTGCGATGAGTG；
蓮子特異性基因-R：TGACATGAACGACATTAACAAAGC；
蓮子特異性基因-P：FAM-CTCCCAGACACTGTAGCATCGGAAGC-BHQ1；
所述步驟2中，所述蕓豆物種特異性基因序列的引物和探針序列如下：
蕓豆特異性基因-F：GTAACCTGGTGAAGCTGAAACG；
蕓豆特異性基因-R：AGCCACGCACGCTAACATC；
蕓豆特異性基因-P：VIC-CTGTTTACTTCGTAGGTTGGAC-MGB。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟1包括將所述蓮蓉樣品采用試劑盒法提取樣品DNA。
3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述雙重數字PCR反應包括ddPCR反應和cdPCR反應。
4.根據權利要求3所述的方法，其特征在于，所述ddPCR反應條件為：95℃，5分鐘，1℃/秒；94℃，15秒，1℃/秒，60℃，1分鐘，1℃/秒，共49個循環；12℃保存反應產物。
5.根據權利要求3所述的方法，其特征在于，所述ddPCR反應體系為20 μL，各組分如下：2×ddPCRTM預混液 10 μL；濃度為10 pmol/μL的引物各0.8 μL，濃度為10 pmol/μL的探針各0.4 μL，DNA模板2 μL，補水至20 μL。
6.根據權利要求3所述的方法，其特征在于，所述cdPCR反應條件為：96℃，10分鐘；60℃，2分鐘，98℃，30秒，49個循環；60℃，2分鐘；10℃保存反應產物。
7.根據權利要求3所述的方法，其特征在于，所述cdPCR反應體系為15 μL，各組分如下：2×QuantStudio?預混液7.5 μL；濃度為10 pmol/μL的引物各0.6 μL、濃度為10 pmol/μL的探針各0.3 μL，DNA模板1.5 μL，補水至15 μL。
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