[發明專利]NK細胞的分離培養及保存入庫的方法

在審

• 申請號: 201910373695.0
• 申請日: 2019-05-07
• 公開（公告）號: CN110079499A
• 公開（公告）日: 2019-08-02
• 發明（設計）人: 任賀
• 申請（專利權）人: 青島大學附屬醫院
• 主分類號: C12N5/0783
• 分類號: C12N5/0783;A01N1/02
• 代理公司: 天津市尚文知識產權代理有限公司 12222
• 代理人: 劉瑞芳

本發明提供一種NK細胞的分離培養及保存入庫的方法，將血站制備血制品過程中濾除掉的白細胞經體外誘導擴增NK細胞，對NK細胞的培養方法進行優化，包括：健康或成年人白細胞的采集、NK細胞的擴增、NK細胞的檢測、NK細胞的存儲及編碼入庫、建立可供檢索的細胞信息檔案。本發明中制備血制品過程中濾除掉的白細胞具有細胞數量大、功能活性強、無傳染性病原體污染等特點，為臨床使用非自體NK細胞治療惡性腫瘤性疾病提供豐富的細胞來源，同時實現NK細胞的高效擴增，凍存的NK細胞復蘇活力達到86％以上，復蘇僅需30?60分鐘，存儲時間可達15?20年，為腫瘤治療和預防，以及病毒感染產生的免疫系統疾病治療和預防提供了儲存新方式。

技術領域

本發明涉及免疫細胞領域，特別涉及一種NK細胞的分離培養及保存入庫的方法。

背景技術

NK細胞是人體免疫系統中最重要的效應殺傷細胞之一，占外周血淋巴細胞的10％～15％，是人體防御體系的第一道屏障，通常處于休眠狀態，一旦被激活，會浸潤到大多數組織中攻擊腫瘤細胞和病毒感染細胞。NK細胞是人體先天免疫的核心組成部分，是抗腫瘤細胞免疫的基礎。由于NK細胞的殺傷活性無主要組織相容性復合物(MHC)限制性，因此稱為自然殺傷活性。NK細胞作用于腫瘤細胞后殺傷效果出現早，在體外1小時、體內4小時即可見到殺傷效應。同時NK細胞彌補了細胞毒性T淋巴細胞在殺傷腫瘤細胞時必須識別MHC-Ⅰ類分子，而無法殺傷此類分子陰性的腫瘤細胞的缺陷。腫瘤患者的NK細胞嚴重受損，這使得它們無法消滅腫瘤細胞，但這為采用NK細胞免疫療法治療腫瘤提供了一個契機。所謂NK細胞免疫療法，即通過細胞工程的方法恢復或者重建NK細胞抗腫瘤的能力，提高NK細胞對抗腫瘤免疫治療的效果。

NK細胞的殺傷功能主要以下三種機制來實現：①NK細胞通過釋放穿孔素和顆粒酶直接殺傷靶細胞；②NK細胞通過膜TNF家族分子與靶細胞膜配體結合誘導靶細胞凋亡；③NK細胞還可以通過其表面CD16分子，與抗體結合，產生抗體依賴細胞介導的細胞毒作用(ADCC)。有研究表明，具有ADCC效應的NK細胞與單克隆抗體藥物聯合應用，能夠更好的發揮抗腫瘤作用。雖然目前有很多NK細胞擴增培養的方法，但仍存在細胞純度低、擴增效率不高、不具有ADCC效應等問題。如何才能獲得大量、具有ADCC效應的NK細胞仍有待進一步研究。

同時，由于NK細胞在人外周血中的含量極低及腫瘤組織中分布頻率較低(〈10％)，僅占單個核細胞的5％-10％，極大的限制了NK細胞作為過繼免疫細胞在臨床上的應用。多年來，人們一直嘗試能在體外實現NK細胞的大量擴增，但是目前的常規技術主要是在體外培養體系中加入IL-2、IL-12、IL-15和Y-1FN等因子組合來促進NK的擴增，經過一段時間的培養后僅可以使NK細胞擴增幾倍或十幾倍，純度亦不理想，因此也不能滿足實際的應用。并且這種方法因子需求量較大，成本較高，培養效果不穩定，不適合體外大規模的應用。

發明內容

本發明旨在一定程度上解決上述相關技術中的技術問題之一。因此，本發明的目的在于提出一種NK細胞的分離培養及保存入庫的方法，具有分離的NK細胞活性高、純度高，復蘇活力達到86％以上，且復蘇時間短，存儲時間長的優點。

一方面，本發明提供一種NK細胞的分離培養及保存入庫的方法，包括以下步驟：

(1)白細胞的采集及運輸；

(2)白細胞的入庫；

(3)分離單個核細胞；任選地，凍存單個核細胞；

(4)擴增培養，獲得NK細胞；

(5)NK細胞的凍存，編碼入庫并上傳細胞信息檔案；

(6)NK細胞檢測

(7)細胞復蘇后存活率、誘導NK等效率

(8)出庫流程