[發明專利]基于表面增強拉曼散射光譜的藍綠藻種群競爭化感作用機制研究方法

有效

• 申請號: 201910368630.7
• 申請日: 2019-05-05
• 公開（公告）號: CN109991208B
• 公開（公告）日: 2021-06-15
• 發明（設計）人: 何石軒;王德強;謝婉誼;方紹熙;周大明
• 申請（專利權）人: 中國科學院重慶綠色智能技術研究院
• 主分類號: G01N21/65
• 分類號: G01N21/65
• 代理公司: 北京同恒源知識產權代理有限公司 11275
• 代理人: 楊柳岸

1.基于表面增強拉曼散射光譜的藍綠藻種群競爭化感作用機制研究方法，其特征在于：該方法包括以下步驟：

S1：制備雙金屬火山口表面增強拉曼散射襯底；

S2：藍綠藻細胞混合培養；

S3：藻細胞表面增強拉曼散射光譜成像表征；

S4：建立藻細胞藻種表面增強拉曼散射光譜判別分析模型；

S5：基于表面增強拉曼散射光譜的藍綠藻種群競爭化感作用機制研究；

所述步驟S1具體為：在經過等離子體或化學方法清洗過的硅或玻璃硬質基底表面上，采用磁控濺射方法，依次鍍金、銀膜，金膜厚度為50-100納米，銀膜厚度為20-50納米；其中，為提高金膜在基底表面的吸附性，在鍍金膜前需鍍2-3納米的鉻；

基于聚焦離子束刻蝕系統，采用氦源，選用10um光闌，束流大小為2pA，在鍍貴金屬膜硬質襯底上制備納米孔陣列；其中，聚焦離子束劑量為14-20nC/μm²；納米孔孔徑為20-40納米，周期為40-100納米；

在氦離子束對上層銀膜刻蝕時，氦離子與銀原子相互作用，摻雜到銀膜里面，產生兩種作用力，一是濺射出銀原子，二是促使銀原子相互擠壓，在納米孔邊沿形成凸起；濺射出的銀原子在未被刻蝕的銀膜表面電荷的作用下，重新沉積在未被刻蝕的銀膜表面；待所述銀膜被刻穿后，開始刻蝕金膜，刻蝕下層金膜過程中濺射出來的金原子，在未被刻蝕的銀膜或納米孔表面電荷的作用下，重新沉積在銀膜未被刻蝕的表面及納米孔四壁和納米孔的邊沿，構建雙金屬火山口表面增強拉曼散射襯底；其中，納米金、銀雙金屬層用于增強納米孔附近單分子的拉曼散射信號，濺射沉積的金原子層用于防止銀原子層的氧化；納米孔邊沿凸起間隙尺寸為20-40納米，在納米孔附近形成復合局域增強電磁場；

所述步驟S2具體為：

分別選取一種藍綠藻種細胞進行滅菌擴大培養，在適宜的溫度和光照下靜止培養，每天搖動1～2次；待兩種藻細胞處于穩定生長期，取相同數量的兩種藻細胞進行混合培養；所述步驟S3具體為：

提取混合培養的藻液并稀釋，取1ul稀釋后的藻液滴到制備好的雙金屬火山口表面增強拉曼散射襯底上，藻細胞固定在火山口納米孔或者火山口納米孔邊沿凸起間隙處，進而采用共聚焦顯微拉曼光譜儀對藻細胞進行成像表征，獲取藻細胞表面增強拉曼散射光譜；

所述步驟S4具體為：

建立不同藻種藻細胞的表面增強拉曼散射光譜標準數據庫，基于判別式最小二乘算法、支持向量機或人工神經網絡，建立藻種表面增強拉曼散射光譜判別分析模型；

所述步驟S5具體為：

利用步驟S2所述的藍綠藻細胞混合培養方法，選擇藍綠藻種進行混合培養，并添加不同濃度的微囊藻毒素或藍藻毒素，培養過程中隔天對混合藻液采樣，采用步驟S3所述的方法對混合藻液進行表面增強拉曼散射光譜成像表征，并對藻細胞種類進行判別，分析不同濃度不同藻毒素誘導下藻細胞表面增強拉曼指紋特征演變規律，進而研究藻毒素在藍綠藻種群競爭中的化感作用。

2.根據權利要求1所述的基于表面增強拉曼散射光譜的藍綠藻種群競爭化感作用機制研究方法，其特征在于：

采用共聚焦顯微拉曼光譜儀對藻細胞進行成像表征的參數為：選擇532nm或785nm激光，激發功率不大于0.01mw，避免藻細胞光損傷，拉曼積分時間小于2秒，積分次數為1-5次，顯微物鏡放大倍數為50或100倍，拉曼成像掃描步長0.5-1um。