[發(fā)明專利]酮基泛解酸內(nèi)酯還原酶及其應(yīng)用

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• 申請日: 2019-05-05
• 公開（公告）號: CN110396505A
• 公開（公告）日: 2019-11-01
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 應(yīng)向賢;汪釗;趙嫚;程先鋒;林行;白彥兵;張麗;陳梁;殷杭華;張連春;毛王偉;余建新;王春霞;鄭世明;何敏
• 申請（專利權(quán)）人: 杭州鑫富科技有限公司;浙江工業(yè)大學(xué)
• 主分類號: C12N9/04
• 分類號: C12N9/04;C12N15/53;C12N15/70;C12P17/04
• 代理公司: 北京集佳知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11227
• 代理人: 潘穎;趙青朵

本發(fā)明涉及微生物基因工程技術(shù)領(lǐng)域，更具體地說，涉及一種全新的源自裂殖酵母的酮基泛解酸內(nèi)酯還原酶及其應(yīng)用。所述酮基泛解酸還原酶對酮基泛解酸內(nèi)酯具有優(yōu)良的酶活性，可以催化酮基泛解酸內(nèi)酯不對稱還原生成D?泛解酸內(nèi)酯。本發(fā)明還構(gòu)建了一菌雙酶反應(yīng)體系，雙酶重組細(xì)胞誘導(dǎo)產(chǎn)生的酮基泛解酸內(nèi)酯還原酶和葡萄糖脫氫酶偶聯(lián)，催化底物酮基泛解酸內(nèi)酯不對稱還原生成D?泛解酸內(nèi)酯，通過輔底物葡萄糖的脫氫將氧化型輔酶NADP⁺還原成NADPH，從而實現(xiàn)輔酶循環(huán)。由于葡萄糖脫氫酶的催化效率遠(yuǎn)高于酮基泛解酸內(nèi)酯還原酶，可以促進(jìn)還原反應(yīng)高速進(jìn)行，極大地提高反應(yīng)效率，降低成本。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及微生物基因工程技術(shù)領(lǐng)域，更具體地，涉及一種源自裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)的酮基泛解酸內(nèi)酯還原酶及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

D-泛酸鈣又稱維生素B5，是輔酶A的組成部分，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、飼料和化妝品等行業(yè)。D-泛解酸內(nèi)酯是合成D-泛酸鈣的重要原料。在工業(yè)化生產(chǎn)上，先通過化學(xué)法合成DL-泛解酸內(nèi)酯，再利用內(nèi)酯水解酶選擇性水解混旋泛解酸內(nèi)酯中的D-泛解酸內(nèi)酯生成D-泛解酸，接著分離D-泛解酸和L-泛解酸內(nèi)酯，分離后的D-泛解酸經(jīng)酸化成環(huán)形成D-泛解酸內(nèi)酯，而L-泛解酸內(nèi)酯經(jīng)消旋化后回用。因此，水解酶催化的手性拆分法盡管工藝成熟，但仍然存在步驟較長、酸堿耗用高等問題。鑒于此，開發(fā)更為直接、高效、環(huán)保的D-泛解酸內(nèi)酯不對稱合成方法替代現(xiàn)有的手性拆分技術(shù)將具有重要的應(yīng)用價值。D-泛解酸內(nèi)酯可通過氧化還原法不對稱合成，該方法包括兩種途徑，第一種是以混旋的DL-泛解酸內(nèi)酯為底物，利用立體選擇性專一的L-泛解酸內(nèi)酯脫氫酶催化L-泛解酸內(nèi)酯脫氫生成酮基泛解酸內(nèi)酯，接著酮基泛解酸內(nèi)酯在D-酮基泛解酸內(nèi)酯還原酶催化下不對稱生成D-泛解酸內(nèi)酯；第二種途徑也是先以L-泛解酸內(nèi)酯脫氫酶催化L-泛解酸內(nèi)酯脫氫生成酮基泛解酸內(nèi)酯，接著酮基泛解酸內(nèi)酯自發(fā)水解形成酮基泛解酸，然后在D-酮基泛解酸還原酶的作用下生成D-泛解酸，接著D-泛解酸在酸的作用下閉環(huán)形成D-泛解酸內(nèi)酯。該過程以第一條通路更為簡捷，與現(xiàn)有的水解酶催化通路相比，工藝更為簡單，混旋的底物經(jīng)生物催化直接得到光學(xué)純產(chǎn)物，不需要消旋步驟，也不需要內(nèi)酯和酸的分離步驟；在基因工程菌內(nèi)構(gòu)建輔酶循環(huán)系統(tǒng)，可不需要外加輔酶；以基因工程菌作為整細(xì)胞催化劑不需要酶的分離純化步驟。因此，氧化還原酶不對稱合成D-泛解酸內(nèi)酯的方法是一種非常有前景的生物水解酶法替代者。

氧化還原法中酮基泛解酸內(nèi)酯不對稱還原生成D-泛解酸內(nèi)酯的步驟是其關(guān)鍵步驟之一，D-酮基泛解酸內(nèi)酯還原酶是催化該反應(yīng)的關(guān)鍵酶。已有研究報道，從釀酒酵母中克隆表達(dá)了2個酮基泛解酸內(nèi)酯還原酶SceCPR1和SceAKR3C1，其中SceAKR3C1屬于醛酮還原酶家族(Zhao M,Gao L,Zhang L,et al.Asymmetric reduction of ketopantolactoneusing a strictly(R)-stereoselective carbonylreductase through efficient NADPHregeneration and the substrate constant-feeding strategy.BiotechnologyLetters,2017,39:1741-1746)。微生物醛酮還原酶是醛酮還原酶家族的主要組成，通常為NADP(H)專一性依賴型，含有高度保守的(α/β)8桶狀結(jié)構(gòu)。微生物醛酮還原酶具有來源的豐富性和催化底物的多樣性等特性，其作為生物催化劑在酶法合成手性醇方面已有成功的應(yīng)用。從微生物醛酮還原酶家族中挖掘具有D-酮基泛解酸內(nèi)酯還原酶活力的酶，是一條可行的策略。

目前，尚未見源自裂殖酵母的醛酮還原酶具有D-酮基泛解酸內(nèi)酯還原酶活力的報道，也未見裂殖酵母的醛酮還原酶用于D-泛解酸內(nèi)酯不對稱合成的報道。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種全新的酮基泛解酸內(nèi)酯還原酶及其應(yīng)用。

本發(fā)明第一方面，提供分離的酮基泛解酸內(nèi)酯還原酶，所述酮基泛解酸內(nèi)酯還原酶來源于裂殖酵母，其氨基酸序列如SEQ ID No:3所示。