[發明專利]一株具有益生活性的丁酸梭菌CG3及其培養方法與應用

有效

• 申請號: 201910361908.8
• 申請日: 2019-04-30
• 公開（公告）號: CN110004094B
• 公開（公告）日: 2022-12-06
• 發明（設計）人: 李升康;李忠貞;紀培娜;張明
• 申請（專利權）人: 汕頭大學
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;A23K10/18;A23K50/80;C12R1/145
• 代理公司: 廣州三環專利商標代理有限公司 44202
• 代理人: 曹江;周增元

本發明涉及一株具有益生活性的丁酸梭菌CG3及其培養方法與應用，保藏于中國典型培養物保藏中心，其保藏編號為CCTCC NO.M2019071。本發明具有益生活性的丁酸梭菌CG3及其合生元顯著提高了魚的生長性能、提高腸道消化酶活，改變腸道菌群的組成和多樣性指數，還富集了許多SCFA產生菌，以及增加魚腸道SCFAs含量。此外，還可以通過調節血清補體和細胞因子水平、溶菌酶活性和腸道抗氧化能力來激活淺色黃姑魚免疫系統。而且無溶血性，對大部分抗生素都敏感，沒有耐藥性，安全性較高；可以作為淺色黃姑魚的飼料添加劑，起到促進生長和防治疾病的作用。

技術領域

本發明屬于丁酸梭菌及其培養，尤其涉及一株具有益生活性的丁酸梭菌CG3及其培養方法與應用。

背景技術

淺色黃姑魚(Nibea Coibor)，俗名白奈，金絲鯢，隸屬于石首魚科，黃姑魚屬，是我國重要的海水養殖經濟魚類，其魚鰾制品“魚膠”，為市場上高級滋補品，備受消費者青睞。但淺色黃姑魚的高密度養殖受細菌性病害的危害極大，導致成魚養殖成活率低，直接影響了淺色黃姑魚養殖業的發展。抗生素及化學藥物在水產動物病害防治中曾發揮重要作用，但因其引起的細菌耐藥性，藥物殘留等負面作用也日益明顯，同時由于人們對水產品質量安全的高度關注，因此生態養殖日益受到重視。目前，益生菌在促進水產動物生長，改善養殖環境，增強抗病力方面已取得明顯效果，但在水產上使用的益生菌僅有乳酸桿菌、鏈球菌、芽胞桿菌、雙歧桿菌以及酵母菌等。因此，開發新的益生菌株對水產養殖的可持續發展意義深遠。

產丁酸菌作為新興益生菌，成為近年來腸道益生菌研究的一個前沿和熱點。但已成功分離到的產丁酸菌株數量稀少，應用于水產養殖中僅丁酸梭菌一種，對于此類菌的系統研究知之甚少，而且也不是很透徹，未來這方面的基礎研究工作還需要更多的關注。

腸道產丁酸菌的研究進展：許多研究參考Barcenilla等(2000)報道的M2GSC培養基分離方法，以體外培養丁酸產量大于2mM為閾值判斷是否為產丁酸菌。但該培養基營養較豐富，滿足腸道內絕大部分微生物的生長，導致分離工作量大，也存在一定的盲目性，不便短時間做出判定，限制了對該類群的深入認識。Barcenilla等(2000)利用厭氧滾管技術從3個健康人(嬰兒，成年素食者和成年雜食者)的新鮮糞樣中分離到313株產丁酸菌，其中從嬰兒糞樣中分離到的產丁酸菌產丁酸濃度最高，產丁酸菌種類最多，素食者次之，雜食者糞樣中產丁酸菌的種類要明顯少于前兩者。研究表明，腸道丁酸的合成除了取決于腸道中產丁酸菌的種類和數量，還與進入后端腸道的碳水化合物數量和種類有關。這也是本發明關注的重點，期望用寡糖和糖醇來體外富集產丁酸菌，從而分離獲得有應用潛力的益生菌株。

益生菌的安全性問題一直備受關注，國內外研究者提出多種安全性評價指標和方法，諸如溶血性、有害代謝產物、毒力因子檢測、抗生素抗性、對胃腸黏膜蛋白的分解能力等體外評價和動物模型評價(馮媛媛，2017)。菌株是否有溶血性是篩選益生菌的先決條件，目前溶血性的評價方法主要是通過血平板培養進行。另一方面，細菌耐藥性的廣泛傳播和多重耐藥菌株的出現已成為嚴重的公共衛生問題，如果益生菌攜帶的抗性基因在養殖環境和食品中發生轉移，將嚴重影響人類健康和惡化養殖環境。

發明內容

本發明的目的在于提供一株具有益生活性的丁酸梭菌CG3及其培養方法與應用，以解決現有技術存在的問題。

通過查閱文獻確定10種功能性寡糖和糖醇，分別與動物的腸道內容物進行體外厭氧發酵實驗，丁酸產量較高的發酵液用來稀釋涂平板分離單菌。各菌株體外培養24h后丁酸產量大于2mM即為產丁酸菌。在淺色黃姑魚養殖試驗中，飼料中添加丁酸梭菌CG3可以提高淺色黃姑魚的生長性能及免疫反應，改善宿主健康及腸道微生態。一株具有益生活性的丁酸梭菌CG3(Clostridium butyricum CG3)，已于2019年1月22日保藏于中國典型培養物保藏中心(China Center for Type Culture Collection，CCTCC)，保藏地址為中國湖北省武漢市武漢大學，其保藏編號為CCTCC NO.M2019071。