[發(fā)明專利]一種檢測(cè)虎細(xì)小病毒的LAMP-LFD試劑盒

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201910361657.3
• 申請(qǐng)日: 2019-04-30
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN110184283A
• 公開(kāi)（公告）日: 2019-08-30
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王開(kāi);胡桂學(xué);裴志花;伊淑帥;董浩
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/35
• 分類號(hào): C12N15/35;C12Q1/70;C12Q1/6844;C12R1/93
• 代理公司: 長(zhǎng)春市東師專利事務(wù)所 22202
• 代理人: 張鐵生;劉延軍

本發(fā)明公開(kāi)了一種檢測(cè)虎細(xì)小病毒的LAMP試劑盒，它包括：所述的一種檢測(cè)虎細(xì)小病毒的LAMP引物；還提供了一種檢測(cè)虎細(xì)小病毒的LAMP檢測(cè)體系，它的具體配置為：2×反應(yīng)緩沖液，11~13μL；FIP，1.5~2.5μL；BIP，1.5~2.5μL；F3，0.5~1.5μL；B3，0.5~1.5μL；Loop?F，0.3~0.7μL；Loop?B，0.3~0.7μL；BstDNA聚合酶，0.5~1.5μL；熒光目視檢測(cè)試劑，0.5~1.5μL；去離子水（DW），1~2μL；樣本溶液，1.5~2.5μL；本發(fā)明具有很強(qiáng)特異性；最低檢測(cè)濃度為1.3 pg/μL，具有較好靈敏性；操作簡(jiǎn)單，對(duì)儀器設(shè)備要求低，反應(yīng)結(jié)果也可通過(guò)肉眼觀察白色渾濁或者綠色熒光的生成來(lái)判斷。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種檢測(cè)虎細(xì)小病毒的LAMP-LFD試劑盒。

背景技術(shù)

細(xì)小病毒是目前動(dòng)物病毒中最小最簡(jiǎn)單的一類單鏈線狀DNA病毒，屬細(xì)小病毒科、細(xì)小病毒屬(Parvovirus)，病毒顆粒無(wú)囊膜。對(duì)細(xì)小病毒易感的宿主范圍很廣，包括脊椎動(dòng)物、無(wú)脊椎動(dòng)物及人類。細(xì)小病毒病發(fā)病率高，傳播廣泛，犬貓等動(dòng)物易感染此病，且發(fā)病時(shí)臨床癥狀與其他腸道疾病不易區(qū)分。細(xì)小病毒在發(fā)現(xiàn)后的多年時(shí)間里，可能由于環(huán)境的改變而發(fā)生了抗原的漂移，在動(dòng)物宿主范圍、血凝特異性和抗原特性上都發(fā)生了改變。例如犬細(xì)小病毒(Canine Parvovirus, CPV-2)，已經(jīng)出現(xiàn)了多個(gè)亞型，即CPV-2a、CPV-2b、CPV-2c和newCPV-2a、newCPV-2b、newCPV-2c等，并且出現(xiàn)了CPV感染大熊貓與虎的報(bào)道，對(duì)大熊貓與虎等珍稀動(dòng)物造成很大的威脅。而在普通動(dòng)物園或野外環(huán)境下，對(duì)該病缺乏有效的檢測(cè)手段，開(kāi)發(fā)一種能應(yīng)用于野外現(xiàn)場(chǎng)條件下的檢測(cè)方法，顯得尤其重要。

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)(Loop-mediated isothermal amplification, LAMP)，針對(duì)靶基因6個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)4種特異引物，在鏈置換DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)的作用下，60~65 ℃恒溫?cái)U(kuò)增，15~60 min左右即可實(shí)現(xiàn)10⁹~10¹⁰倍的核酸擴(kuò)增。LAMP-LFD技術(shù)通過(guò)將LAMP引物中的上游內(nèi)引物FIP、環(huán)引物L(fēng)F分別進(jìn)行生物素標(biāo)記和異硫氰酸熒光素標(biāo)記后進(jìn)行基因組 DNA的恒溫?cái)U(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物采用具有生物素抗體和異硫氰酸熒光素抗體的橫向流動(dòng)試紙條(Lateral flow dipstick, LFD)進(jìn)行檢測(cè)，肉眼直接觀察結(jié)果。和其他LAMP產(chǎn)物檢測(cè)手段相比，LFD操作簡(jiǎn)便，安全無(wú)污染，不需任何儀器設(shè)備；通過(guò)探針的特異性雜交進(jìn)一步降低結(jié)果的假陽(yáng)性。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明目的是提供一種虎細(xì)小病毒CHJL-Siberian tiger-01株VP2基因及操作簡(jiǎn)單、快捷的檢測(cè)虎細(xì)小病毒的LAMP試劑盒。

一種虎細(xì)小病毒CHJL-Siberian tiger-01株VP2基因，其核苷酸序列如序列表SEQNO.1所示。

一種檢測(cè)虎細(xì)小病毒的LAMP試劑盒，它包括LAMP引物：

F3：ACTAACTTTGGTGATATAGGAGT

B3：CCAAATGCATATCTTGGATCA

FIP：GCTGGTCTCATAATAGTAGCTTCAG-TCAACAAGATAAAAGACGTGGT

BIP：TTGAAGCGTCTACACAAGGGC-TTCATCTGTTTGCGCTCC。

一種檢測(cè)虎細(xì)小病毒的LAMP試劑盒，它的具體配置為：

2×反應(yīng)緩沖液 11~13μL

FIP 1.5~2.5 μL