[發(fā)明專利]一種耐金屬離子和有機(jī)溶劑的羧酸酯酶及其應(yīng)用

有效

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• 申請日: 2019-04-30
• 公開（公告）號: CN110066759B
• 公開（公告）日: 2022-05-17
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 廖祥儒;黃琳;楊邵嵐;孟迪;蔡宇杰;管政兵
• 申請（專利權(quán)）人: 江南大學(xué)
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/70;A62D3/02;B09B3/70;C12R1/19
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠(yuǎn)知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 23211
• 代理人: 林娟

本發(fā)明公開了一種耐金屬離子和有機(jī)溶劑的羧酸酯酶及其應(yīng)用，屬于酶工程領(lǐng)域。本發(fā)明將氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的羧酸酯酶BaCEs04在大腸桿菌中異源表達(dá)，得到的羧酸酯酶BaCEs04在Zn²⁺，NH⁴⁺存在下，分別提高了24.3％和23.5％的酶活，其余金屬離子Na⁺，K⁺，Mg²⁺，Ca²⁺，Cu²⁺，F(xiàn)e³⁺對酶活幾乎沒有影響甚至有略微的提高，說明該羧酸酯酶在存在金屬離子的環(huán)境中較為穩(wěn)定。該酶在丙酮，正己烷，異丙醇中放置1h后，酶活分別提高了22％、30％、26％，說明該酶具有較好的有機(jī)溶劑耐受性。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種耐金屬離子和有機(jī)溶劑的羧酸酯酶及其應(yīng)用，屬于酶工程領(lǐng)域。

背景技術(shù)

羧酸酯酶(carboxylesterase，EC 3.1.1.1)是指能夠催化水解羧酸酯生成羧酸和醇的非特異性酯酶。羧酸酯酶在生產(chǎn)和實(shí)際生活中應(yīng)用廣泛，并且已經(jīng)得到了越來越多現(xiàn)代藥物工業(yè)、手性化合物合成以及精細(xì)化工等相關(guān)行業(yè)的青睞。利用羧酸酯酶作為催化劑催化手性分子合成，例如生產(chǎn)萘普生和2-芳基萘酸；同時羧酸酯酶也被作為綠色催化劑降解土壤中的農(nóng)藥殘留及土壤、水體中的塑化劑鄰苯二甲酸酯類。由于產(chǎn)自動植物的羧酸酯酶存在著酶活低、產(chǎn)量少、提取復(fù)雜、熱穩(wěn)定性差等缺陷，而微生物來源的羧酸酯酶具有良好的區(qū)位選擇性和立體選擇性，可以高效溫和的催化酯類和酰胺類化合物的水解、酯合成和酯交換等反應(yīng)，在食品工業(yè)、生物去污劑、醫(yī)藥、能源開發(fā)和環(huán)境保護(hù)等相關(guān)領(lǐng)域都具有廣闊的應(yīng)用前景。

微生物中羧酸酯酶存在于真菌、細(xì)菌及個別種類的放線菌中。真菌在其中承擔(dān)著重要作用，真菌中12屬23種可產(chǎn)生羧酸酯酶；由于真菌來源的羧酸酯酶表達(dá)量少、酶活較低，而細(xì)菌來源的羧酸酯酶容易獲得，酶學(xué)性質(zhì)優(yōu)異，催化效率高，所以細(xì)菌來源的羧酸酯酶越來越受到人們的關(guān)注。在細(xì)菌中羧酸酯酶主要存在于包括鏈球菌、乳桿菌、假單胞菌中。而野生菌中羧酸酯酶的表達(dá)量較低，不能滿足工業(yè)應(yīng)用；隨著基因工程應(yīng)用于羧酸酯酶的研究中，很多羧酸酯酶基因得到了異源表達(dá)。

但目前大部分羧酸酯酶對于金屬離子和有機(jī)溶劑的耐受性較低，嚴(yán)重限制了羧酸酯酶的應(yīng)用。例如謝振榮等人從脂環(huán)酸芽孢桿菌中克隆得到的羧酸酯酶CarE3和CarE5在1mM的不同金屬離子Cu²⁺，Zn²⁺，Ag⁺，F(xiàn)e³⁺中放置1h后，剩余的相對酶活均小于15％；將其放置于不同有機(jī)溶劑乙醇、甲醇、異丙醇和丙酮中放置1h后，酶活分別降低了28％、45％、70％和49％。Chenghong Wang等人從廢水桿菌屬中克隆得到的羧酸酯酶，當(dāng)其在10mM不同金屬離子中放置1h后，Zn²⁺，Ca²⁺，F(xiàn)e³⁺對酶活性有輕度的抑制作用，而NH₄⁺，Mg²⁺，Cu²⁺，Ag⁺嚴(yán)重抑制的酶的活性。Nehad Noby等人從極端微生物中克隆出的酯酶EstN7，當(dāng)其在5mM的不同金屬離子中，酶活性受到Cu²⁺，Zn²⁺，Ca²⁺，Na⁺金屬離子不同程度的抑制作用。

且由于羧酸酯酶的大部分底物都是難溶于水的，耐有機(jī)溶劑的羧酸酯酶可以在含有有機(jī)溶劑的緩沖液(代替水相緩沖液)中更好的作用于底物，因此，獲得一種既耐金屬離子又耐有機(jī)溶劑的羧酸酯酶，在工業(yè)應(yīng)用中將具有十分重要的價(jià)值和意義。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的第一個目的是提供一種降解含有金屬離子或有機(jī)溶劑的體系中鄰苯二甲酸酯類的方法，是以氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的羧酸酯酶為催化劑，降解鄰苯二甲酸酯類。