[發(fā)明專利]一種基于RPA-側(cè)流層析技術(shù)檢測栗黑水疫霉的引物和探針組合及其應(yīng)用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201910361142.3
• 申請日: 2019-04-30
• 公開（公告）號(hào): CN110066885A
• 公開（公告）日: 2019-07-30
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 戴婷婷;陸辰晨;焦彬彬;汪澳華
• 申請（專利權(quán)）人: 南京林業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): C12Q1/6895
• 分類號(hào): C12Q1/6895;C12Q1/6844;C12Q1/04;C12N15/11;C12R1/645
• 代理公司: 北京輕創(chuàng)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11212
• 代理人: 王佳妹

本發(fā)明公開了一種基于重組酶介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增?側(cè)流層析技術(shù)(RPA?LFD)檢測栗黑水疫霉(Phytophthora cambivora)的引物及探針組合及其應(yīng)用。采用所述引物及探針組合檢測栗黑水疫霉(P.cambivora)的具體方法為：1)提取待測樣本DNA；2)以DNA為模板，進(jìn)行RPA擴(kuò)增；3)應(yīng)用側(cè)流層析試紙條進(jìn)行擴(kuò)增產(chǎn)物檢測。本發(fā)明所使用的引物及探針組RPA擴(kuò)增效果好，條帶特異性強(qiáng)，與其他病菌無交叉反應(yīng)，在質(zhì)控區(qū)有陽性對(duì)照，增加了檢測的靈敏性，為栗黑水疫霉(P.cambivora)的檢測提供了新的技術(shù)平臺(tái)，同時(shí)適用于栗黑水疫霉病菌寄主苗木、插枝等植物材料及其土壤和介質(zhì)中的栗黑水疫霉(P.cambivora)進(jìn)行檢測。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及基于RPA-LFD檢測栗黑水疫霉的方法，以及專用引物及探針組合。

背景技術(shù)

栗黑水疫霉(Phytophthora cambivora)屬于卵菌門(Oomycota)、卵菌綱(Oomycetes)、霜霉目(Peronosporales)、腐霉科(Pythiaceae)、疫霉屬(Phytophthora)。栗黑水疫霉主要危害寄主的根、莖，引發(fā)樹木的多種病害，如栗樹的黑水病，桃樹的根腐病，挪威槭的莖潰瘍病等。目前對(duì)該病害還沒有有效的防治措施，加強(qiáng)檢疫，防止病原菌的傳播擴(kuò)散是控制該病的最有效措施。為此應(yīng)加強(qiáng)疫情監(jiān)測，建立快速檢測方法，為病害的風(fēng)險(xiǎn)及研究決策提供依據(jù)，從而有利于降低疫病引起的損失。

為了阻止栗黑水疫霉(P.cambivora)傳播范圍的不斷擴(kuò)大，使栗黑水疫霉根腐病得到控制，需要對(duì)其進(jìn)行快速、準(zhǔn)確地檢測。栗黑水疫霉的傳統(tǒng)檢測方法耗時(shí)長、靈敏度低、易受人為及環(huán)境等諸多因素的干擾，不能在病害潛伏期和初發(fā)期作出診斷；從土壤中分離病原菌可能會(huì)同時(shí)得到多種病原菌和非病原菌，鑒定病原菌難度較大，而且采用傳統(tǒng)檢測方法難以估測病原菌量，很難對(duì)病害發(fā)生進(jìn)行及時(shí)的監(jiān)測和有效控制，所以傳統(tǒng)的檢測方法逐步被分子檢測技術(shù)所取代。近年來，已經(jīng)開發(fā)了許多檢測致病真菌的分子方法。DNA探針檢測技術(shù)很早就被用于研究和開發(fā)的植物病原真菌檢測。在中國，這項(xiàng)技術(shù)也被用于真菌病原體的檢測。然而，在實(shí)際應(yīng)用方面，因?yàn)楹怂崽结樀闹苽湎鄬?duì)困難，這種技術(shù)操作復(fù)雜，雜交和標(biāo)本處理成本昂貴并且耗時(shí)。此外，可重復(fù)性差，以及可能造成的假陽性或假陰性，都是這項(xiàng)技術(shù)可能存在的一些問題。在PCR技術(shù)出現(xiàn)以來，已經(jīng)被證明是一種快速、準(zhǔn)確、靈敏、操作簡單的檢測技術(shù)，且被廣泛應(yīng)用于檢測植物病原真菌，真菌識(shí)別，和系統(tǒng)發(fā)育研究等領(lǐng)域。實(shí)時(shí)定量PCR是美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司1996年開發(fā)的，就有快速、靈敏、準(zhǔn)確、定量、可重復(fù)性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。這項(xiàng)技術(shù)已經(jīng)成為分子生物學(xué)的一個(gè)重要工具。然而，考慮到實(shí)用性，檢測致病真菌需要快速，操作簡單，盡可能降低成本，盡量不依賴于昂貴的設(shè)備。需要可以在農(nóng)場或基層這些設(shè)備相對(duì)落后的單位推廣使用。重組酶介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(RecombinasePolymerase Amlification，RPA)技術(shù)被公認(rèn)是可以替代PCR的核酸檢測技術(shù)。其原理是利用重組酶與引物結(jié)合形成蛋白-DNA復(fù)合物，能在雙鏈DNA中尋找同源序列。一旦引物定位了同源序列，就會(huì)發(fā)生鏈交換反應(yīng)形成并啟動(dòng)DNA合成，對(duì)模板上的目標(biāo)區(qū)域進(jìn)行指數(shù)式擴(kuò)增。另外，RPA技術(shù)有多重工具酶匹配進(jìn)行有效擴(kuò)增，擴(kuò)增效率遠(yuǎn)高于傳統(tǒng)的PCR技術(shù)，所用時(shí)間更短，最短可在5min內(nèi)實(shí)現(xiàn)。由于RPA技術(shù)具有擴(kuò)增用時(shí)短、不需昂貴儀器、特異性好等特點(diǎn)，使其應(yīng)用越來越廣泛。RPA技術(shù)的最大特點(diǎn)是只需要1對(duì)引物即可在37℃左右的恒溫條件下實(shí)現(xiàn)模板核酸的擴(kuò)增，不需要通過高低溫度循環(huán)實(shí)現(xiàn)核酸解鏈和退火，因此不需要昂貴的儀器設(shè)備。而且37℃的常規(guī)反應(yīng)溫度很容易滿足，適合基層對(duì)病原菌的快速檢測。目前，RPA技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于人體、動(dòng)物或植物上的病毒檢測，但在植物病原卵菌的檢測方面，尤其是對(duì)于栗黑水疫霉的RPA檢測，未見相關(guān)應(yīng)用報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容