[發明專利]一種時間分辨熒光定量檢測25羥基維生素D的試劑盒及方法

有效

• 申請號: 201910357266.4
• 申請日: 2019-04-29
• 公開（公告）號: CN109975559B
• 公開（公告）日: 2023-07-11
• 發明（設計）人: 張云;張肖;宋良
• 申請（專利權）人: 廈門稀土材料研究所
• 主分類號: G01N33/82
• 分類號: G01N33/82;G01N33/58;G01N33/577;G01N33/533;G01N33/558;G01N21/64
• 代理公司: 浙江千克知識產權代理有限公司 33246
• 代理人: 冷紅梅

1.一種時間分辨熒光定量檢測25羥基維生素D的試劑盒，包括時間分辨熒光試紙卡、樣本解離液和含有定標曲線的ID卡，其特征在于：

所述時間分辨熒光試紙卡包括檢測試紙條，所述檢測試紙條由底襯以及粘貼在底襯上的濾血膜樣品墊、玻璃纖維結合墊、硝酸纖維素膜和吸水紙組成，所述濾血膜樣品墊、玻璃纖維結合墊、硝酸纖維素膜和吸水紙順次搭接粘貼在底襯上；

所述濾血膜樣品墊處噴涂有樣品墊處理液；

所述結合墊設置有微球線，噴涂有時間分辨熒光微球標記的25羥基維生素D單克隆抗體，所述時間分辨熒光微球為稀土釩酸鹽納米顆粒，粒徑為150±50nm，其組成為LnVO4:xEu，其中，LnVO4為基質，Ln為鑭、釔、釓、釤、鋱中的一種或多種；冒號“：”表示為銪摻雜；x為Eu的摩爾百分數，范圍是5%～50%；25羥基維生素D單克隆抗體的含量為50~200μg抗體/200μl熒光微球；所述稀土釩酸鹽納米顆粒按如下方法制備獲得：在50?ml圓底燒瓶中，加入水20ml，0.35?mmol?Gd(NO₃)₃，0.15?mmol?Eu(NO₃)₃，2?mmol檸檬酸鈉，0.5?mmol?原釩酸鈉，通入氮氣，85℃反應24小時，10000?rpm離心，用蒸餾水洗滌3次，干燥得到分散性好的水溶性GdVO4:30%?Eu納米熒光探針；

所述硝酸纖維素膜上依次設置有檢測線和質控線，檢測線和質控線相互平行，間隔距離為3~5mm，其中檢測線靠近加樣孔，質控線遠離加樣孔；

所述檢測線包被有25羥基維生素D重組抗原，質控線包被有羊抗鼠IgG抗體；25羥基維生素D重組抗原包被濃度為0.1~2mg/ml、用量為0.5~1.5μl包被液量/cm膜，羊抗鼠IgG抗體包被濃度為0.5~2mg/ml、用量為0.5~1.5μl包被液量/cm膜；

所述樣本解離液為含20mM?乙酸鈉，1%（w/w）氯化膽堿，1%（w/w）Tween-20的50mM、pH8.0Tris-HCl緩沖液。

2.如權利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述檢測試紙條由如下方法制備：

（1）稀土釩酸鹽納米熒光微球的制備方法

在50?ml圓底燒瓶中，加入水20?ml，0.35?mmol?Gd(NO₃)₃，0.15?mmol?Eu(NO₃)₃，2?mmol檸檬酸鈉，0.5?mmol?原釩酸鈉，通入氮氣，85℃反應24小時，10000?rpm離心，用蒸餾水洗滌3次，干燥得到分散性好的水溶性GdVO4:30%?Eu納米熒光探針；

（2）時間分辨熒光微球的活化

超聲波處理熒光微球2min后，取200μl熒光微球以14000rpm高速離心5~15min后，沉淀物用10~100mM，pH為5.0~7.0的MES溶液洗滌至1ml，超聲波處理2min；加入10~100μl的20~100mg/ml碳二亞胺，混勻5~10min，再加入50~200μl的20~100mg/ml?N-羥基硫代琥珀酰亞胺，混勻10~20min后14000rpm高速離心5~15min，沉淀用pH為5.0~7.0的MES溶液洗滌至1ml；

（3）時間分辨熒光微球標記25羥基維生素D單克隆抗體的制備

在上述活化后的熒光微球超聲波處理2min后按照50~200μg/200μl加入25羥基維生素D單克隆抗體，混勻1~3小時，用含0.5%BSA的10~50mM、pH7.5~8.5?Tris-HCl封閉液封閉0.5~1小時后14000rpm高速離心5~15min，用含1%（w/w）NaCl、0.5%（w/w）BSA、0.1%（w/w）Tween-20的10~50mM、pH7.5~8.5?Tris-HCl保存液洗滌并重懸至200μl于4℃避光保存；

（4）樣品墊的制備

用樣品墊處理液在濾血膜上平行均勻噴涂兩條線，用量為2~4μl液量/cm樣品墊，所述樣品墊處理液為含0.5%NaCl、0.5%Tween-20、0.1%BSA的20mM、pH8.0的Tris-HCl；

（5）結合墊的制備

在結合墊上將時間分辨熒光微球標記的25羥基維生素D單克隆抗體用微球稀釋液稀釋8~30倍均勻噴涂一條線，用量為2~4μl液量/cm樣品墊；置于烘箱中，37℃烘干過夜；所述樣品墊處理液為含0.5%NaCl、0.5%Tween-20、0.1%BSA的20mM、pH8.0的Tris-HCl；所述微球稀釋液為含0.5%BSA、30%蔗糖的20mM?Tris-HCl緩沖液；

（6）包被膜的制備

分別用包被緩沖液將25羥基維生素D重組抗原和羊抗鼠IgG抗體調整濃度到0.5~2mg/ml，用量為0.5~1.5μl包被液量/cm膜，分別作為檢測線和質控線平行劃于硝酸纖維素膜上進行包被，質控線和檢測線間隔3~7mm，置于烘箱中，45℃烘干過夜；

（7）在底襯上順次相互搭接地粘貼樣品墊、結合墊、包被膜和吸水紙得到試紙板，切割得到所述試紙條。