[發明專利]一套用于獲取館藏甲蟲標本DNA條形碼的Mini-Barcoding引物及其應用

有效

• 申請號: 201910356710.0
• 申請日: 2019-04-29
• 公開（公告）號: CN110331210B
• 公開（公告）日: 2022-08-02
• 發明（設計）人: 陳曉勝;黃衛東;梁馨月;王曉雙;王興民;邱寶利;吳建輝
• 申請（專利權）人: 華南農業大學
• 主分類號: C12Q1/6888
• 分類號: C12Q1/6888;C12Q1/6809;C12N15/11
• 代理公司: 廣州粵高專利商標代理有限公司 44102
• 代理人: 林麗明

本發明公開了一套用于獲取館藏甲蟲標本DNA條形碼序列的Mini?Barcoding引物，由引物對Cocc301、Cocc286和Cocc214或引物對Cocc301和Cocc413或引物對Cocc301、Cocc286、Cocc214和Cocc658或引物對Cocc301、Cocc413和Cocc658組成。使用普通PCR或巢式PCR技術，通過擴增甲蟲標本兩段或三段目的基因片段，然后拼接成完整的館藏甲蟲標本DNA條形碼序列。本發明設計的迷你條形碼引物具有很好的擴增效率，克服了傳統條形碼引物擴增效率低的問題，尤其是對于年代久遠的館藏標本具有極高的擴增效率，使用本發明設計的引物可以高效的獲取館藏甲蟲標本DNA條形碼序列，豐富甲蟲DNA條形碼數據庫，為利用DNA條形碼鑒定甲蟲提供參考。

技術領域

本發明屬于昆蟲分子鑒定技術領域，更具體地，涉及一套用于獲取館藏甲蟲標本DNA條形碼的Mini-Barcoding引物及其應用。

背景技術

甲蟲是鞘翅目(Coleoptera)昆蟲的統稱。目前，世界甲蟲種類已超過38萬種，占昆蟲總數的40％，是昆蟲中數量最多的一個類群。甲蟲豐富的生態多樣性，使其在陸地和淡水生態系統中扮演著重要的角色。為適應多樣的棲息地環境，甲蟲在體型大小、形態和結構方面展現出極度的多樣化。因此通過傳統形態特征去鑒定和區分甲蟲非常困難，尤其是在某些傳統分類還不完善的類群中。所以，從分子層面鑒定和區分豐富的甲蟲種類顯得尤為重要。

Tautz等(2002)首先提出DNA分類的概念，以DNA序列為基礎建立物種識別體系，利用DNA序列的差異進行種級階元的分類。隨后Hebert等(2003)提出DNA條形碼的概念，即利用線粒體細胞色素氧化酶亞基I基因(COI，Cytochrome oxidase)作為通用序列，建立全球性的物種鑒別系統。自DNA條形碼提出以來，已在多個類群的研究中得到了應用。包括真菌、珊瑚、腹足類、昆蟲、兩棲類、魚類等。

由于采集新鮮樣本不僅費時費力，而且很難覆蓋全面的物種種類，因此在獲取瓢蟲的DNA條形碼序列時，經常會使用到館藏標本。由于通常保存昆蟲標本的方法都是針插，隨著時間的推移，標本中的DNA會發生降解和斷裂，因此很難使用通用引物來獲取完整的DNA條形碼序列。為解決此問題，Van Houdt等(2010)提出設計新的通用引物來擴增長為269～363bp的幾個短片段，然后將其連接在一起得到條形碼全長序列，然而所述引物存在擴增效率低的問題，而且不能用于檢測館藏時間較長的標本。

發明內容

本發明的目的在于克服現有技術的上述不足，提供一套用于獲取館藏甲蟲標本DNA條形碼的Mini-Barcoding引物組。

本發明的另一目的在于提供一套獲取館藏甲蟲標本DNA條形碼的方法。

本發明的上述發明目的是通過以下技術方案給予實現的：

一套用于獲取館藏甲蟲標本DNA條形碼序列的Mini-Barcoding引物組，由引物對Cocc301、Cocc286和Cocc214或引物對Cocc301和Cocc413或引物對Cocc301、Cocc286、Cocc214和Cocc658或引物對Cocc301、Cocc413和Cocc658組成；所述引物對Cocc301、Cocc286、Cocc214、Cocc413與Cocc658的序列依次如SEQ ID NO.1～10所示。

本發明以瓢蟲COI基因序列為基礎，設計了大量Mini-Barcoding引物組，最終篩選得到上述Mini-Barcoding引物組，通過使用所述引物組，利用普通PCR或巢式PCR技術，可以擴增館藏甲蟲標本兩段或三段目的基因片段，然后拼接成完整的館藏甲蟲標本DNA條形碼序列。通過采自1973～2013年的30頭館藏甲蟲干標本來檢驗本發明上述引物組的擴增效率，結果表明所述Mini-Barcoding引物組具有很好的擴增效率，尤其是對于年代久遠的館藏標本具有極高的擴增效率，使用本發明設計的引物可以高效的獲取館藏甲蟲標本DNA條形碼序列，豐富甲蟲DNA條形碼數據庫，為利用DNA條形碼鑒定甲蟲提供參考。