[發明專利]一種幽門螺桿菌絲氨酸蛋白酶的表達優化及純化方法

在審

• 申請號: 201910356684.1
• 申請日: 2019-04-29
• 公開（公告）號: CN110042093A
• 公開（公告）日: 2019-07-23
• 發明（設計）人: 趙肅清;王甜甜;肖益熱;陳莉莉;葉遠志
• 申請（專利權）人: 廣東工業大學
• 主分類號: C12N9/52
• 分類號: C12N9/52;C12N15/57;C12N15/70
• 代理公司: 廣州粵高專利商標代理有限公司 44102
• 代理人: 林麗明

1.一種幽門螺桿菌重組絲氨酸蛋白酶的表達優化及純化方法，其特征在于，包括如下步驟：

S1.對重組載體pET-22b-HtrA的HtrA基因片段進行基因C末端的定點突變，然后在基因片段的C末端添加6×His標簽，得含有組氨酸標簽的重組絲氨酸蛋白酶基因片段HtrA-His；將目的蛋白編碼基因序列插入重組載體pET-22b-HtrA的多克隆位點酶切位點5’Nde I和3’Sal I之間，得目的蛋白表達載體pET-22b-HtrA-His；再將成功連接的pET-22b-HtrA-His導入宿主細胞E.coil BL21中，即獲得含有重組載體pET-22b-HtrA-His的E.coil BL21工程菌；

S2.在優化表達條件下培養轉化的宿主菌，實現融合蛋白可溶性表達；所述優化條件為：以IPTG為誘導物對宿主菌進行誘導表達，誘導濃度為125～500μmol/L，誘導溫度為28～37℃，預誘導表達時間為2～4h，誘導表達時間為3～7h；

S3.收集步驟S2所得誘導后的宿主菌并經反復凍融進行裂解；充分裂解后，離心并棄去沉淀，收集上清，得粗蛋白液；

S4.采用鎳親和層析法分離目的融合蛋白，先用含2mM咪唑的緩沖液體系沖洗去除非特異性結合的雜蛋白，再在含50mM咪唑的緩沖液體系條件下洗脫獲得目的蛋白，再以300mM為高濃度咪唑洗脫去除未沖洗干凈的與填料結合蛋白，收集50mM咪唑洗脫液，即得融合的目的蛋白。

2.根據權利要求1所述表達優化及純化方法，其特征在于，步驟S2中所述IPTG的誘導濃度為200～300μmol/L。

3.根據權利要求2所述表達優化及純化方法，其特征在于，步驟S2中所述IPTG的誘導濃度為200μmol/L。

4.根據權利要求1所述表達優化及純化方法，其特征在于，步驟S2中所述誘導溫度為35～37℃。

5.根據權利要求4所述表達優化及純化方法，其特征在于，步驟S2中所述誘導溫度為37℃。

6.根據權利要求1所述表達優化及純化方法，其特征在于，步驟S2中所述預誘導表達時間為3～4h。

7.根據權利要求1所述表達優化及純化方法，其特征在于，步驟S2中所述預誘導表達時間為4h。

8.根據權利要求1所述表達優化及純化方法，其特征在于，步驟S2中所述誘導表達時間為4～6h。

9.根據權利要求1所述表達優化及純化方法，其特征在于，步驟S2中所述誘導表達時間為5h。

10.權利要求1至9任一項所述表達優化及純化方法在表達純化生物大分子目的蛋白中的應用。