[發明專利]一株淺黃霉素基因簇敲除的須糖多孢菌工程菌株及其應用

有效

• 申請號: 201910354543.6
• 申請日: 2019-04-29
• 公開（公告）號: CN110029069B
• 公開（公告）日: 2022-11-29
• 發明（設計）人: 夏立秋;何昊城;穰杰;丁學知
• 申請（專利權）人: 湖南師范大學
• 主分類號: C12N1/15
• 分類號: C12N1/15;C12N15/90;C12N15/52;C12P19/62;C12R1/645
• 代理公司: 長沙星耀專利事務所(普通合伙) 43205
• 代理人: 寧星耀

一株淺黃霉素基因簇敲除的須糖多孢菌工程菌株及其應用，所述淺黃霉素基因簇敲除的須糖多孢菌工程菌株也稱為12號基因簇敲除菌（Saccharopolyspora pogona?△cluster12），于2019年1月22日保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCC NO：M 2019070。將本發明淺黃霉素基因簇敲除的須糖多孢菌工程菌株應用于丁烯基多殺菌素的生物合成，與利用原始菌株S.pogona進行丁烯基多殺菌素的生物合成相比，丁烯基多殺菌素的產量提高6倍以上。

技術領域

本發明涉及一株淺黃霉素基因簇敲除的須糖多孢菌工程菌株及其應用。

背景技術

使傳統化學農藥是當前控制農業病蟲害的主要方法，但是，長期依賴和大量使用化學農藥，對環境造成了嚴重的破壞，食品安全也無法得到保障。隨著人們環保意識的增強和生活品質的提高，生物農藥因其選擇性強、不傷害天敵、無污染和不易產生抗性等優點，越來越受到人們的關注。

丁烯基多殺菌素(butenyl-spinosyn)是由須糖多孢菌 (Saccharopolyspora pogona)產生的一類與多殺菌素結構類似的大環內酯類抗生素。到目前為止，丁烯基多殺菌素組分共檢測到 31 種，這類化合物具有很好的防治農林害蟲、衛生害蟲和線蟲的作用，是當今世界上最具發展前景的新型生物農藥之一。然而，現有丁烯基多殺菌素產生菌的發酵產量低，生長周期長，限制了這一綠色生物農藥的工業化生產和推廣應用。因此，提高丁烯基多殺菌素產量對于農業害蟲防治及生物安全具有重要的意義。

2018年，Li等人首次通過基因工程技術完成對須糖多孢菌聚核苷酸磷酸激酶基因(pnp)研究，并獲得高產突變株，使得利用基因工程技術對須糖多孢菌基因組進行定向遺傳修飾成為提高丁烯基多殺菌素產量的有效方法（Impact on strain growth and butenyl-spinosyn by overexpression of polynucleotide phosphorylase gene inSaccharopolyspora pogona, Li L等，102（18）：8011-8021，2018）。但效果尚欠理想。

發明內容

本發明要解決的技術問題是，克服現有技術的不足，提供一株淺黃霉素基因簇敲除的須糖多孢菌工程菌株，旨在利用該淺黃霉素基因簇敲除的須糖多孢菌工程菌株進行丁烯基多殺菌素的生物合成，提高丁烯基多殺菌素生物合成的產量，降低丁烯基多殺菌素生產成本。

本發明解決其技術問題采用的技術方案是，一株該淺黃霉素基因簇敲除的須糖多孢菌工程菌株，即12號基因簇敲除的工程菌株，也即須糖多孢菌S. pogona-△cluster12，Saccharopolyspora pogona-△cluster12，于2019年1月22日保藏于中國典型培養物保藏中心(簡稱CCTCC，地址：中國武漢武昌區，武漢大學)，菌種保藏編號為CCTCC NO:M2019070。

所述淺黃霉素基因簇，為須糖多孢菌基因組聚酮合成基因簇，其基因簇序列如序列表SEQ ID№.1所示。

本發明之淺黃霉素基因簇敲除的須糖多孢菌工程菌株的構建方法如下：

（1）提取須糖多孢菌NRRL 30141基因組，分別擴增1 Kb大小的淺黃霉素基因簇上下游同源臂；

（2）將sgRNA與上下游同源臂進行融合，與質粒pKCcas9dO進行酶連，獲得重組質粒pKCcas9-sgRNA-UHA-DHA;

（3）接合轉移構建工程菌株S. pogona-△cluster12及其PCR鑒定；