[發明專利]長效重組FSH融合蛋白在母豬批次化生產中的應用

在審

• 申請號: 201910349958.4
• 申請日: 2019-04-28
• 公開（公告）號: CN110041435A
• 公開（公告）日: 2019-07-23
• 發明（設計）人: 雷瑤;侯永敏;李梅;陳成涌;黃虎;張玉杰
• 申請（專利權）人: 廣州威生醫藥科技有限公司
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;C12N15/85;C07K1/22;A61K38/24;A61P15/08
• 代理公司: 北京林達劉知識產權代理事務所(普通合伙) 11277
• 代理人: 劉新宇;李茂家

1.重組FSH融合蛋白在母豬批次化生產中的應用，其特征在于，所述融合蛋白任選自：

(i)重組hFSH-Fc融合蛋白的氨基酸序列從N端到C端依次包含信號肽、hFSHβ亞基、CTP、hFSHα亞基、肽接頭和Fc，其中所述Fc為IgG2-hFc變體或IgG1-hFc變體；或，

(ii)重組hFSH-Fc融合蛋白的氨基酸序列從N端到C端依次包含信號肽、pFSHβ亞基、CTP、pFSHα亞基、肽接頭和Fc，其中所述IgG Fc變體為pFc、IgG2-hFc變體或IgG1-hFc變體中的任一種。

2.根據權利要求1所述的應用，其中(i)和(ii)中所述的肽接頭含有2-20個氨基酸，所述肽接頭存在于hFSHα亞基和IgG Fc變體之間，且肽接頭含有兩個或更多選自甘氨酸、絲氨酸、丙氨酸和蘇氨酸的氨基酸；優選的，所述肽接頭的氨基酸序列為GlySerGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySer。

3.根據權利要求1或2所述的應用，其中(i)和(ii)中所述的CTP的氨基酸序列為來自HCGβ鏈羧酸基末端的33個氨基酸殘基序列，如SEQ ID NO：20所示。

4.根據權利要求1～3中任一項所述的應用，其中(i)中所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4所示；其中(ii)中所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：10所示。

5.根據權利要求1～4中任一項所述的應用，其中所述母豬為經產母豬或后備母豬。

6.根據權利要求1～5中任一項所述的應用，其中所述重組FSH融合蛋白的制備方法包括以下步驟：

a)構建編碼重組hFSH-Fc或pFSH-Fc融合蛋白的基因表達載體

采用人工合成方法獲得編碼人hFSH-Fc或pFSH-Fc融合蛋白的基因，插入到哺乳動物細胞表達載體，獲得含有hFSH-Fc或pFSH-Fc融合蛋白基因的表達質粒；

b)重組hFSH-Fc或pFSH-Fc融合蛋白在哺乳動物宿主細胞中的穩定表達將含有hFSH-Fc或pFSH-Fc融合蛋白的表達載體轉染到哺乳動物宿主細胞，篩選穩定表達hFSH-Fc或pFSH-Fc融合的細胞株；

c)高密度細胞培養重組hFSH-Fc或pFSH-Fc融合蛋白

d)重組hFSH-Fc或pFSH-Fc融合蛋白的純化：包括使用Protein A親和層析和疏水層析柱進行純化，其中所述的疏水柱包括Butyl Sepharose4 Fast Flow、Octyl Sepharose4Fast Flow、Phenyl Sepharose6 Fast Flow、Butyl-S Sepharose 6 Fast Flow、ButylSepharose 4B、Octyl Sepharose CL-4B、Phenyl Sepharose CL-4B，優選為PhenylSepharose 6 Fast Flow。

7.根據權利要求6所述的應用，其中所述的基因表達載體為pCDNA3、pCMV/ZEO、pIRES、pDR、pBK、pSPORT或pCMV-DHFR，優選為pCDNA3，更優選為經過基因改造后的pCDNA3；其中所述的細胞轉染方法包括電穿孔轉染方法、磷酸鈣轉染、脂質體轉染和原生質融合，優選為電穿孔轉染方法；其中所述的哺乳動物宿主細胞包括CHO、HEK293、BHK、NS0和Sp2/0細胞，優選為CHO細胞，更優選為DHFR酶缺陷型CHO懸浮細胞(CHO DHFR^-)。